Imaging time-lapse della migrazione radiale dei neuroni corticali in fette di cervello embrionale di topo trasdotto

Prendiamo un inserto di membrana contenente fette di cervello organotipico embrionale di topo trasdotto, dove i neuroni e le cellule gliali radiali esprimono proteine fluorescenti, consentendone la visualizzazione.

Utilizzando la microscopia a fluorescenza, selezionare una fetta con neuroni corticali fluorescenti che migrano radialmente verso la superficie piale della fetta utilizzando scaffold gliali radiali intatti.

Trasferire l'inserto della membrana con la fetta selezionata in un piatto con fondo di vetro con terreno per supportare l'attività cellulare durante l'imaging.

Posizionare la capsula nella camera climatizzata del microscopio confocale invertito per garantire la vitalità cellulare.

Regola i parametri di imaging per acquisire immagini nitide riducendo al minimo il fotodanneggiamento.

Quindi, configura uno Z-stack nella regione di destinazione per visualizzare le strutture cellulari.

Avvia l'imaging time-lapse a intervalli regolari.

Analizzare le immagini per valutare la migrazione radiale dei neuroni corticali dalla zona subventricolare verso la placca corticale lungo gli scaffold gliali radiali, evidenziando i modelli di migrazione neuronale.

Selezionare una fetta di cervello per l'imaging visualizzando le fette attraverso un microscopio invertito. Scegli una fetta con singoli neuroni luminosi nella SVZ superiore, che migrano radialmente verso la superficie pial della fetta.

La presenza di sottili processi fluorescenti di cellule gliali radiali che coprono l'intera piastra corticale indica un'impalcatura gliale radiale intatta, che viene utilizzata dai neuroni corticali in migrazione.

Trasferire l'inserto a membrana con una fetta selezionata in una piastra con fondo di vetro di 50 millimetri di diametro contenente 2 millilitri di terreno di coltura a fette. Posizionare il piatto nella camera climatica del microscopio confocale.

Impostare la risoluzione su 512 x 512 pixel. Aumenta la velocità di scansione da 400 hertz a 700 hertz per aumentare la frequenza dei fotogrammi da circa 1,4 a circa 2,5 fotogrammi al secondo. Utilizzare non più di due volte la media.

Definisci uno Z-stack attraverso la regione elettroporata con una dimensione del passo di 1,5 micron. Inizia la serie di time lapse prendendo una pila Z ogni 30 minuti. Le impostazioni descritte consentono di ottenere una risoluzione e una luminosità sufficienti dell'immagine, mantenendo bassa la fotodanneggiamento durante l'acquisizione.