Ablazione laser selettiva a singolo neurone in una larva di zebrafish utilizzando un microscopio confocale

Prelevare una soluzione di agarosio preriscaldata contenente una larva di pesce zebra transgenica anestetizzata che esprime una proteina fluorescente nei motoneuroni spinali.

Trasferire la larva in un piatto di vetro con un anello di agarosio.

Usando un microscopio, gira la larva su un lato. Quindi, lasciare solidificare l'agarosio, immobilizzando la larva.

Aggiungere un tampone contenente anestetico per mantenere l'anestesia.

Posizionare il piatto sul tavolino del microscopio confocale e utilizzare l'imaging a campo chiaro per localizzare la regione dorsale del midollo spinale.

Passa alla modalità di fluorescenza per visualizzare i motoneuroni fluorescenti.

Determina il piano z centrale del soma cellulare per un targeting preciso dell'ablazione.

Configura i parametri di imaging per l'acquisizione ad alta risoluzione riducendo al minimo il fotodanno.

Una volta che il piano z desiderato è a fuoco, esegui l'ablazione sulla regione del neurone bersaglio utilizzando un laser ultravioletto focalizzato.

L'energia laser distrugge le strutture cellulari, causando la perdita di fluorescenza e la morte cellulare. La perdita irreversibile di fluorescenza conferma un'ablazione precisa senza influire sulle cellule circostanti.

Usa una pipetta regolabile per aspirare una larva e lasciarla affondare sul fondo del puntale. Immergere la larva in un volume minimo di liquido nell'agarosio preriscaldato, quindi aspirare il pesce con l'agarosio e distribuirlo rapidamente in un piatto di vetro da 35 millimetri con fondo di vetro precedentemente preparato. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare un pennello standard per posizionare l'animale, o più animali, all'interno dell'agarosio sui lati, in modo che il corpo e la coda siano piatti.

Lasciare riposare il pesce incorporato per 10-15 minuti fino a quando l'agarosio non si sarà ben solidificato. Quindi, utilizzare circa due millilitri di acqua d'uovo con trikane per rabboccare accuratamente la capsula di Petri da 35 millimetri. Posizionare la capsula di Petri con una larva incorporata sul tavolino del microscopio confocale e, utilizzando l'illuminazione a campo chiaro e l'ingrandimento 40X, mettere a fuoco il lato dorsale del midollo spinale dell'animale. Passa a un'impostazione fluorescente appropriata e visualizza la struttura di interesse per confermare che tutti i parametri di imaging siano necessari per la successiva ablazione.

Per determinare lo spessore della struttura per l'ablazione laser UV, utilizzare l'unità Z per verificare la parte superiore e inferiore della struttura di interesse mettendo a fuoco manualmente su e giù. Registra manualmente il piano Z che verrà ablato, ad esempio il centro della cella. Per eseguire l'ablazione laser, avviare la procedura guidata FRAP facendo clic sul menu a discesa nella parte superiore del menu del software.

Dalla nuova finestra, è possibile determinare i parametri dell'immagine per l'approccio all'ablazione selezionando il formato, la velocità di scansione e la media. Se il piano Z per l'ablazione non è già stato selezionato, premere il pulsante live e mettere a fuoco il campione fino a quando la struttura fluorescente, o il piano Z desiderato da ablare, non è a fuoco. Una volta impostati i parametri generali dell'immagine, accedi alla fase di decolorazione per controllare i componenti specifici dell'ablazione, quindi attiva il laser a 405 nanometri attivandolo per la procedura di sbiancamento.

Quindi, utilizza l'opzione di zoom avanti per massimizzare l'intensità dello sbiancamento al ROI selezionato riducendo il campo di scansione, massimizzando così il tempo di permanenza. Selezionare una o più ROI per l'ablazione utilizzando uno qualsiasi degli strumenti di disegno nella finestra di acquisizione dell'immagine. Prendi di mira la collinetta dell'assone, ad esempio, con lo strumento di disegno circolare di circa 4-8 micrometri.

Dopo aver stabilito la ROI, selezionare il pulsante dell'andamento temporale e confermare il numero di cicli, le ROI verranno scansionate e ablate. Scegli i fotogrammi pre-bleach e post-bleach come desiderato per consentire una panoramica dell'intera immagine appena prima e immediatamente dopo il processo di sbiancamento.

Queste impostazioni consentono ai ricercatori più livelli di raffinatezza. Attraverso la regolazione della potenza del laser, della velocità di scansione, della media delle linee, delle dimensioni della regione di interesse e delle ripetizioni, questa tecnica offre un alto grado di libertà per causare stress o morte nelle singole cellule.

Dopo aver stabilito tutti i parametri di ablazione necessari, premere Esegui esperimento e monitorare l'efficienza dell'ablazione. Per ulteriori dettagli, fare riferimento al protocollo di testo.