Ablazione laser selettiva a singolo neurone in una larva di zebrafish utilizzando un microscopio confocale

Prelevare una soluzione di agarosio preriscaldata contenente una larva di pesce zebra transgenica anestetizzata che esprime una proteina fluorescente nei motoneuroni spinali.

Trasferire la larva in un piatto di vetro con un anello di agarosio.

Usando un microscopio, gira la larva su un lato. Quindi, lasciare solidificare l'agarosio, immobilizzando la larva.

Aggiungere un tampone contenente anestetico per mantenere l'anestesia.

Posizionare il piatto sul tavolino del microscopio confocale e utilizzare l'imaging a campo chiaro per localizzare la regione dorsale del midollo spinale.

Passa alla modalità di fluorescenza per visualizzare i motoneuroni fluorescenti.

Determina il piano z centrale del soma cellulare per un targeting preciso dell'ablazione.

Configura i parametri di imaging per l'acquisizione ad alta risoluzione riducendo al minimo il fotodanno.

Una volta che il piano z desiderato è a fuoco, esegui l'ablazione sulla regione del neurone bersaglio utilizzando un laser ultravioletto focalizzato.

L'energia laser distrugge le strutture cellulari, causando la perdita di fluorescenza e la morte cellulare. La perdita irreversibile di fluorescenza conferma un'ablazione precisa senza influi