Imaging a doppia fluorescenza per identificare gli oligodendrociti differenziati

Prendiamo una coltura di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC), isolate dal cervello di un cucciolo di ratto, che sono state indotte a differenziarsi in oligodendrociti. Le cellule sono fissate per preservare l'architettura cellulare.

Gli oligodendrociti differenziati esprimono la proteina basica della mielina, o MBP, un marcatore degli oligodendrociti maturi, mentre sia le OPC che le cellule differenziate esprimono il fattore di trascrizione degli oligodendrociti 2, o Olig2.

Applicare una soluzione che blocca la permeabilizzazione e incubare con agitazione, permeabilizzando le membrane cellulari e bloccando i siti di legame non specifici.

Aggiungere gli anticorpi primari mirati ai marcatori e incubare con agitazione per consentire il legame.

Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati, quindi aggiungere diversi anticorpi secondari coniugati con fluorofori specifici per gli anticorpi primari e incubare con agitazione.

Lavare le cellule, quindi inserirle in un sistema di imaging a doppia fluorescenza.

Utilizzare la luce di lunghezze d'onda specifiche per eccitare i fluorofori distinti e rilevare i segnali emessi per visualizzare i marcatori.

Identificare oligodendrociti differenziati che esprimono olig2 e MBP tra le OPC indifferenziate che esprimono solo olig2.

Portare il piatto a temperatura ambiente. Aspirare i pozzetti e aggiungere 250 microlitri di DPBS contenenti il 5% di NGS e lo 0,1% di Triton X-100. Incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora agitando delicatamente gli orbitali. Preparare la soluzione di incubazione primaria diluendo l'anticorpo monoclonale anti-MBP di topo e l'anticorpo policlonale anti-OLIG2 di coniglio in DPBS contenente il 5% di NGS. Quindi, incubare gli anticorpi primari a 4 gradi Celsius durante la notte per 16-18 ore con un leggero agitamento orbitale.

Durante il lavaggio della piastra, preparare la soluzione di incubazione secondaria diluendo gli anticorpi anti-topo 680 e anti-coniglio 800 in DPBS contenente il 5% di NGS. Successivamente, aspirare il lavaggio finale e aggiungere 250 microlitri di soluzione di incubazione secondaria. Proteggere la piastra dalla luce e incubarla a temperatura ambiente per un'ora agitando delicatamente le onde orbitali.

Successivamente, scansiona la lastra utilizzando un sistema di imaging in grado di rilevare emissioni di fluorescenza a 700 nanometri e 800 nanometri. Come punto di partenza, impostare l'offset focale su 3 e le sensibilità su 1,5 per MBP, 5,0 per actina e 3,5 per OLIG2. Regolare i valori di sensibilità secondo necessità per evitare la sovraesposizione del segnale.