Misurazione dell'espressione proteica nel cervello dei roditori mediante fluorescenza nel vicino infrarosso e scansione ad alta risoluzione

Prendi un vetrino contenente sezioni di tessuto cerebrale di ratto immunocolorate per i recettori AMPA e NMDA nei neuroni dell'amigdala.

I recettori AMPA mediano l'afflusso di sodio indotto dal glutammato e la trasmissione sinaptica eccitatoria veloce.

Al contrario, i recettori NMDA mediano l'afflusso di sodio e calcio indotto dal glutammato e dai co-agonisti, facilitando la lenta trasmissione sinaptica eccitatoria.

I recettori sono colorati con anticorpi primari e rilevati utilizzando anticorpi secondari marcati con fluorofori nel vicino infrarosso.

Posizionare il vetrino con il fazzoletto rivolto verso il basso sull'interfaccia di scansione nel vicino infrarosso.

Regolare i parametri di imaging e iniziare l'imaging.

Dopo l'illuminazione laser, i fluorofori sui recettori AMPA e NMDA emettono fluorescenza.

L'imaging nel vicino infrarosso riduce al minimo l'autofluorescenza, migliorando la chiarezza del segnale.

La scansione ad alta risoluzione garantisce inoltre una chiara differenziazione dei segnali di fluorescenza, consentendo una visualizzazione precisa dei recettori AMPA e NMDA vicini nell'amigdala.

Utilizzando il software di imaging, è possibile calcolare il rapporto di intensità della fluorescenza AMPA/NMDA in una specifica regione di interesse come indicatore di apprendimento e memoria.

Posizionare i vetrini sull'interfaccia di scansione nel vicino infrarosso con il tessuto rivolto verso il basso. Immagine di più diapositive contemporaneamente utilizzando uno strumento di selezione. Immagini dei vetrini utilizzando l'impostazione di massima qualità, con una risoluzione di 21 micrometri. In un offset di 0 nanometri, importare le immagini nel software di analisi delle immagini per visualizzarle e contrassegnarle per l'analisi semiquantitativa delle proteine.

Dopo aver aperto il software di analisi delle immagini, selezionare l'area di lavoro in cui è stata scansionata l'immagine. Quindi, aprire l'immagine acquisita nel software di analisi delle immagini per visualizzare la scansione e regolare le lunghezze d'onda, il contrasto, la luminosità e l'ingrandimento visualizzati senza alterare l'immagine grezza o l'emissione totale quantificata.

Dopo aver identificato le regioni chiave per la quantificazione, selezionare la scheda Analisi nella parte superiore della pagina, quindi selezionare Disegna rettangolo per disegnare un rettangolo sull'area che verrà quantificata. Per visualizzare le dimensioni del rettangolo, selezionare Forme nella parte inferiore sinistra dello schermo. Quindi, seleziona Colonne in basso a destra. Quindi, aggiungi le colonne Altezza e Larghezza per identificare la dimensione della forma. Infine, dai un nome alla forma e ripeti. Una volta campionate tutte le regioni, procedere con la combinazione e l'analisi dei dati disponibili nella scheda Colonne.