Visualizzazione dei mitocondri all'interno delle fibre nervose intraepidermiche

Inizia con una sezione di tessuto cutaneo epidermico contenente fibre nervose intraepidermiche o IENF, sottili terminazioni neuronali sensoriali.

Le IENF sono ricche di mitocondri, che forniscono energia per la trasmissione del segnale neuronale.

Il tessuto ha IENF, mitocondri e nuclei epidermici marcati in modo fluorescente.

Utilizzando un microscopio confocale invertito, acquisisci in sequenza segnali fluorescenti discreti a lunghezze d'onda appropriate per nuclei, IENF e mitocondri.

Attiva una scansione in tempo reale per catturare il segnale IENF, che comprende lo strato epidermico.

Quindi, eseguire la scansione sequenziale per ciascun segnale per eliminare la diafonia del segnale di fluorescenza.

Dall'immagine combinata, utilizzando il software, ritagliare e isolare le cellule epidermiche a fluorescenza blu.

Quindi, elaborare l'area ritagliata per migliorare la risoluzione dei segnali IENF verdi e dei segnali mitocondriali rossi.

Quindi, genera un'immagine di superficie 3D per creare una maschera per gli IENF, quindi sovrapponila all'immagine della superficie mitocondriale per isolare i mitocondri specifici del nervo.

Nell'output finale, gli IENF appaiono in ciano, mentre i mitocondri appaiono come minuscole strutture color magenta.

Scegliete l'obiettivo a immersione in olio 40x su un microscopio confocale a scansione laser invertita. Seleziona i laser e i rilevatori appropriati per l'imaging dei nuclei, delle fibre nervose e dei mitocondri. Inserire i seguenti parametri di scansione nel software del microscopio con risoluzione dell'intensità a 12 bit. Velocità di scansione di 600 Hz con media di due fotogrammi e zoom di 2,2. Impostare il software del microscopio per ottimizzare la risoluzione laterale selezionando una risoluzione di scansione di 1024 per 1024. Ottimizza la risoluzione assiale e il sezionamento ottico selezionando un'apertura confocale di un'unità ariosa con una dimensione del passo z di 210 nanometri.

Scansiona ogni segnale separatamente e regola la tensione e l'offset del rilevatore per rimuovere eventuali pixel sovra e sottosaturi. Attiva una scansione in tempo reale per il segnale nervoso e regola il controllo della messa a fuoco z per trovare e impostare i piani focali superiore e inferiore nel software del microscopio che racchiudono il segnale nervoso all'interno della sezione di tessuto. Scansiona l'ultima serie z con la scansione sequenziale per eliminare la diafonia del segnale fluorescente.

Isolare l'epidermide dallo strato corneo e dal derma disegnando una regione attorno all'epidermide, utilizzando uno strumento di selezione su un'immagine duplicata dell'immagine originale. Quindi ritaglia l'immagine in base alla selezione. Calcola le funzioni di diffusione dei punti per i segnali confocali di fluorescenza verde e rosso, utilizzando la funzione di calcolo della funzione di diffusione. Quindi impostare i parametri per l'indice di rifrazione medio per l'olio a 1,515 e l'apertura numerica per l'obiettivo dell'olio 40x a 1,25. Impostare il foro stenopeico del rivelatore su un'area, un'unità e scegliere una lunghezza d'onda di eccitazione laser.

Utilizzare il ripristino iterativo impostato su un'affidabilità del 100%, un limite di iterazione di 10 cicli e le PSF verdi e rosse per la deconvoluzione dei segnali di fluorescenza verde e rosso. Utilizzare lo strumento Crea superficie per creare una superficie attorno ai segnali nervosi deconvolti, selezionando la funzione liscia non controllata, l'intensità assoluta per la soglia, una soglia inferiore di 3.000 e una soglia superiore di 65.535. Mantieni le superfici sopra i 10 voxel.

Rimuovere le superfici non nervose utilizzando la scheda Modifica nella superficie nervosa per selezionare singole superfici non nervose oppure tenere premuto il tasto Ctrl per selezionare più superfici non nervose. Eliminare le superfici non nervose selezionate premendo il pulsante Elimina. Utilizzare la scheda Modifica nella superficie nervosa e premere il pulsante Maschera tutto nelle proprietà della maschera.

Nella nuova finestra, seleziona Canale 5 Mitocondri deconvoluti sotto la selezione Canale, quindi seleziona Canale duplicato prima di applicare la maschera. Premere il pulsante di opzione per costante interno esterno e controllare la superficie esterna dei voxel impostata su 0.0. E premere il pulsante OK.

Infine, creare superfici specifiche per i mitocondri utilizzando lo strumento Crea superficie per creare una superficie attorno ai segnali mitocondriali deconvolti mascherati selezionando l'opzione Arrotonda e utilizzando la sottrazione dello sfondo per la soglia. Impostare il diametro della sfera più grande a 1,50 micrometri, la soglia inferiore a 2.000 e la soglia superiore a un massimo di 65.535. Assicurati di mantenere le superfici al di sopra di 1,0 voxel.