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Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:31 min • May 29th, 2025
Inizia con una camera di imaging contenente un espiante cerebrale di Drosophila immobilizzato immerso in un tampone per mantenere la funzione cellulare.
I neuroni nel cervello esprimono indicatori citoplasmatici fluorescenti di calcio, che si legano agli ioni calcio e diventano fluorescenti.
Posizionare la camera di imaging sotto un microscopio a fluorescenza dotato di una lente a immersione in acqua.
Abbassa l'obiettivo e, in condizioni di illuminazione a campo chiaro, concentrati sul cervello.
Passa alla modalità di fluorescenza e cattura l'immagine.
Successivamente, introduci un neuropeptide nel tampone e avvia la registrazione time-lapse.
Il neuropeptide si lega al suo recettore sui neuroni, innescando la segnalazione intracellulare. Questo apre i canali del calcio e consente l'afflusso di ioni calcio.
Questi ioni calcio si legano agli indicatori e aumentano l'intensità della fluorescenza.
Ricattura l'immagine dopo la stimolazione con neuropeptidi.
Confronta le immagini prima e dopo la stimolazione dei neuropeptidi.
Un aumento dell'intensità della fluorescenza dopo la stimolazione con neuropeptidi riflette la risposta del cervello di Drosophila alla segnalazione dei neuropeptidi.
Per acquisire immagini a fluorescenza del calcio, posizionare al microscopio la camera di imaging contenente l'espiante cerebrale. Abbassare la lente dell'obiettivo fino a toccare il PBS. E sotto l'illuminazione a campo chiaro, posiziona il cervello e mettilo a fuoco.
Passa alla luce fluorescente e regola la messa a fuoco sulle celle etichettate GCaMP6. Avviare l'acquisizione a 250 millisecondi per fotogramma con una risoluzione di 512 x 512 pixel in modalità raffreddata ad acqua. Quindi, regolare il tempo di esposizione per ottenere i valori di fluorescenza all'interno della gamma dinamica della telecamera CCD, ma non inferiori a 1.000 unità arbitrarie con immagini a 16 bit.
Una volta determinati i parametri di imaging, scattare le immagini per un minuto prima della somministrazione del peptide per rilevare l'intensità del segnale di base. Successivamente, applicare il peptide di prova direttamente pipettando 100 microlitri della soluzione peptidica preparata nel bagno larvale. Registrare l'emissione GCaMP6 per alcuni minuti.