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Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:56 min • May 29th, 2025
Prendi una sezione sagittale del cervello di un topo per esporre i ventricoli, che sono cavità piene di liquido cerebrospinale, o CSF.
Le cellule ependimali che rivestono i ventricoli possiedono ciglia mobili che spingono il liquido cerebrospinale per facilitarne la circolazione.
Metti la sezione in un piatto con fondo di vetro contenente un mezzo ricco di sostanze nutritive per sostenere l'attività ciliare.
Trasferire la capsula nella camera climatizzata di un microscopio a contrasto di interferenza differenziale, o DIC, per mantenere la vitalità cellulare durante l'imaging.
La microscopia DIC impiega un prisma per dividere la luce polarizzata, dirigendola attraverso il campione lungo diversi percorsi.
Le variazioni dell'indice di rifrazione nel campione introducono differenze di fase tra i fasci.
Un secondo prisma ricombina i raggi, creando un'interferenza che produce un'immagine ad alto contrasto con un effetto tridimensionale, migliorando la visibilità delle strutture fini.
Localizzare le cellule ependimali funzionali con ciglia mobili osservando il movimento delle bolle generato dal loro battito.
Utilizzando l'imaging DIC ad alto contrasto, registrare le ciglia per quantificare la loro frequenza di battimento.
Per visualizzare le sezioni, posizionare le fette di cervello in piastre di coltura con fondo di vetro da 30 millimetri contenenti 1 millilitro di terreno ad alto contenuto di glucosio e regolare l'ambiente della camera del microscopio chiuso a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, utilizzando una lente a immersione in olio dell'obiettivo 60x.
Quindi, concentrati sulle celle con la normale luce trasmessa DIC. Quindi, seguendo la direzione del movimento della bolla DMEM, come guida per la posizione delle ciglia ependimali mobili, utilizzare il filtro DIC per selezionare un'area contenente cellule sane con ciglia mobili nel ventricolo laterale del cervello. Dopo aver identificato le ciglia ependimali, regolare la luce e mettere a fuoco per ottenere un'immagine soddisfacente.
Quindi, impostare i parametri di imaging in tempo reale nel software di imaging. Ad esempio, qui vengono acquisite immagini a 24 bit, con il binning della fotocamera impostato su 1 volte 1, combinato con l'obiettivo 60x e un tempo di esposizione da 5 a 10 millisecondi.
Aprire l'apertura del microscopio al livello ottimale per un tempo di esposizione minimo e raccogliere le immagini DIC. Osserva il flusso di immagini in tempo reale alla telecamera per fornire un'acquisizione rapida e immediata delle immagini senza ritardi. La velocità di battitura delle ciglia può quindi essere calcolata in base al requisito dei tempi di esposizione minimi per ottenere un contrasto d'immagine sufficiente.