Identificazione dei sottotipi di cellule gangliari retiniche di topo mediante tracciatura fluorescente

Posizionare un tessuto retinico isolato da un topo transgenico con cellule gangliari retiniche marcate in fluorescenza, o RGC, in una camera di registrazione.

Le informazioni visive vengono trasmesse alle RGC, i cui assoni le trasmettono al cervello attraverso il nervo ottico.

I

sottotipi RGC si distinguono per i modelli ramificati dei loro dendriti, che si stratificano in sottostrati all'interno dello strato retinico interno.

Appiattire il tessuto retinico e fissarlo con un ancoraggio tissutale.

Trasferire la camera su un tavolino da microscopio e perfondere una soluzione ossigenata per mantenere la vitalità dell'RGC.

Utilizzando l'illuminazione a infrarossi, identificare gli RGC fluorescenti.

Posizionare una pipetta contenente un tracciante fluorescente su un RGC.

Applicare una pressione positiva per evitare l'intasamento.

Passare alla pressione negativa, aspirando la membrana nella pipetta per formare una guarnizione.

Applicare l'aspirazione per rompere la membrana, stabilendo una configurazione a cellula intera che facilita la diffusione del tracciante nei dendriti.

Osservare la morfologia e la stratificazione dendritica per identificare i sottotipi RGC.

Lavare la retina nella soluzione extracellulare ossigenata e trasferirla in una camera di registrazione con fondo di vetro con una pipetta di trasferimento in plastica. Successivamente, usa una pinza per appiattire con cura il tessuto con lo strato di fotorecettori rivolto verso il basso. Rimuovere il liquido in eccesso utilizzando una pipetta. E ancorare il tessuto utilizzando un anello di platino con rete di nylon. Quindi riempire la camera con la soluzione extracellulare ossigenata e montarla su un tavolino da microscopio. Perfondere il tessuto con la soluzione extracellulare ossigenata a una velocità compresa tra 2 e 4 millilitri al minuto.

Per prepararsi a questa procedura, estrarre alcune micropipette di vetro per registrazioni elettrofisiologiche utilizzando un estrattore per micropipette. Osservare lo strato di cellule gangliari utilizzando l'ottica IR-DIC. Quindi identificare le cellule gangliari GFP plus utilizzando l'epifluorescenza a circa 480 nanometri. Quindi, individuare la pipetta riempita con soluzione intracellulare in DIC. Applicare una leggera pressione positiva e azzerare eventuali offset di tensione sull'amplificatore.

Successivamente, abbassare la micropipetta di vetro su una cella GFP-positiva e applicare i passaggi di comando della tensione di prova per monitorare la resistenza di tenuta. La pressione negativa dovrebbe formare una tenuta Giga ohm tra la pipetta e la membrana cellulare. Dopo aver formato una tenuta stabile, rompere la membrana applicando brevi impulsi di pressione negativa per ottenere l'accesso all'intera cellula. Attendere uno o due minuti affinché i dendriti della cellula si riempiano di tracciante fluorescente.