JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:33 min. • May 29th, 2025
Iniziare con un gruppo di perfusione posizionato sul tavolino di un microscopio invertito.
L'assemblaggio di perfusione contiene un nervo periferico sezionato fissato tra un vetrino coprioggetti e un vetrino per microacquedotto con perfusione salina continua.
Gli assoni mielinizzati del nervo esprimono i neurofilamenti verdi marcati con fluorofori.
Utilizzando l'illuminazione a campo chiaro, concentrarsi sugli assoni mielinizzati.
Passa alla modalità confocale, fotosbianca con un'elevata potenza laser, quindi acquisisci un'immagine di riferimento a bassa autofluorescenza utilizzando una bassa potenza laser.
Disegna linee parallele lungo l'assone per definire la lunghezza della finestra di fotoattivazione. Usalo come guida per creare una regione di attivazione rettangolare.
Illumina questa regione con una lunghezza d'onda specifica per attivare i neurofilamenti verdi marcati con fluoroforo, provocandone la fluorescenza. Acquisisci l'immagine.
Dopo l'attivazione, acquisire immagini time-lapse.
Nel tempo, i neurofilamenti fluorescenti si muovono in entrambe le direzioni e si diffondono nelle regioni adiacenti ai fianchi.
La comparsa di fluorescenza nelle regioni fiancheggianti adiacenti alla regione di attivazione conferma il trasporto dei neurofilamenti.
Afferra l'estremità prossimale del nervo e stendilo lentamente su un vetrino coprioggetti. Quindi, raddrizzarlo con una leggera tensione. Posizionare il micro scivolo dell'acquedotto sul nervo con il cursore scanalato verso il basso e posizionare la direzione del flusso parallelamente al nervo. Capovolgere il vetrino copricoperchio e il gruppo del microacquedotto e posizionarlo nell'alloggiamento della camera di perfusione con il vetrino opposto alla guarnizione esterna.
Per fissare la camera di perfusione, posizionarla nell'alloggiamento metallico e ruotare l'anello di bloccaggio. Premere lentamente lo stantuffo della siringa salina e riempire la camera di perfusione. Tenere sempre il tubo di ingresso e di uscita, il pallone di uscita e la siringa sollevati sopra la camera stessa durante la configurazione e l'imaging. Trasferire il gruppo di perfusione su un tavolino per microscopio invertito e montare la siringa salina nella pompa a siringa. Quindi, avviare il motore e regolare la velocità per una portata di 0,25 millilitri al minuto.
Collegare il riscaldatore della soluzione in linea e impostarlo a 37 gradi Celsius. Collegare il riscaldatore dell'obiettivo e impostarlo a 37 gradi Celsius. Applicare olio all'obiettivo e inserire la camera di perfusione nel supporto del tavolino. Applicare olio sul cuscinetto del riscaldatore della camera e fissarlo alla camera di perfusione. Quindi, collegalo e impostalo a 37 gradi Celsius.
Bloccare la camera di perfusione nell'adattatore del tavolino e portare l'olio dell'obiettivo a contatto con il vetrino coprioggetto sul lato inferiore della camera. Utilizzare l'illuminazione a campo chiaro per mettere a fuoco lo strato di assoni sulla superficie inferiore del nervo più vicino alla superficie del vetrino coprioggetti. Gli assoni mielinizzati possono essere identificati dalla presenza di una guaina mielinica, visibile in condizioni di illuminazione a luce trasmessa in campo chiaro senza aumento del contrasto.
Acquisire un'immagine di riferimento in campo chiaro, registrando la direzionalità del nervo. Quindi acquisire un'immagine confocale utilizzando un laser a 488 nanometri e un filtro di emissione appropriato per la GFP fotoattivabile. Impostare la potenza del laser su una potenza di imaging circa cinque volte superiore alla normale e acquisire un'immagine con un tempo di esposizione di tre o quattro minuti. Quindi acquisire un'altra immagine confocale per registrare l'autofluorescenza pre-attivazione dopo la fase di sbiancamento.
Tracciare una linea parallela agli assoni con una lunghezza pari alla dimensione della finestra di attivazione desiderata dell'immagine in campo chiaro. Usando questa linea come guida, disegna una regione rettangolare di interesse attraverso il campo visivo perpendicolare agli assoni. Attivare la fluorescenza GFP in questa regione mediante eccitazione con la luce a 405 nanometri, assicurandosi che un'immagine venga acquisita appena prima e immediatamente dopo l'attivazione. Al termine dell'attivazione, avviare un timer di un minuto. Quando si spegne, avvia l'acquisizione di una serie time-lapse.