Microscopia a due fotoni per l'imaging della morfologia neuronale in un cucciolo di topo

Inizia impostando la luce di eccitazione per il microscopio a due fotoni.

Prendete un cucciolo di topo transgenico anestetizzato con una finestra circolare di imaging in vetro e una piastra per la testa impiantata nel cranio.

I neuroni esprimono proteine fluorescenti rosse per facilitare l'imaging.

Pulire la finestra di imaging in vetro e fissare il cucciolo sullo stadio di imaging a due fotoni.

Allineare la finestra di imaging con l'obiettivo del microscopio regolando la testa del cucciolo.

Usa un termoforo per mantenere la temperatura corporea del cucciolo.

Regolare la portata dell'anestetico.

Applicare una goccia d'acqua sul vetrino coprioggetti, quindi abbassare la lente dell'obiettivo del microscopio.

La microscopia a due fotoni utilizza due fotoni di luce per attivare le proteine fluorescenti, consentendo un imaging neuronale dettagliato con rumore di fondo e fotosbiancamento minimi.

Cattura immagini dei neuroni a varie profondità per visualizzare la loro struttura

Infine, impila le immagini per generare una rappresentazione tridimensionale del neurone, comprese le loro proiezioni neuronali, per studiare i cambiamenti morfologici legati alla crescita.

Per iniziare l'imaging, impostare prima la lunghezza d'onda del laser a due fotoni. Per l'eccitazione RFP, utilizzare una lunghezza d'onda di 1.000 nanometri. Pulire la superficie del vetrino coprioggetto con etanolo al 70%. Fissare il cucciolo anestetizzato alla piastra di titanio sul tavolino di imaging utilizzando la barra di titanio. Utilizzare il tavolino goniometrico per regolare la testina in modo che il vetrino coprioggetto sia parallelo alla lente dell'obiettivo.

Mantenere la temperatura corporea del cucciolo durante l'imaging, utilizzando un termoforo impostato a 37 gradi Celsius, e ridurre la concentrazione di isoflurano dallo 0,7% all'1%. Posizionare il tavolino di imaging sotto la lente dell'obiettivo 20X del microscopio a due fotoni. Applicare una goccia d'acqua sul vetrino coprioggetti.

Impostare il software per acquisire immagini z-stack a intervalli di 1,4 micron. Per l'imaging dei neuroni del quarto strato, impostare la larghezza z tra 150 e 300 micron per visualizzare l'intera morfologia dendritica. Utilizzare la scansione lenta e la media per ottenere immagini chiare che mostrino la morfologia neuronale.

Di solito ci vogliono più di 20 minuti per acquisire l'intera morfologia dendritica.