JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:54 min • May 29th, 2025
Fissare una Drosophila transgenica immobilizzata con la testa esposta in una camera di registrazione su un tavolino per microscopio a fluorescenza.
Il corpo del fungo della mosca comprende neuroni che esprimono la proteina di fusione bioluminescente sensibile al calcio, che viene attivata da un cofattore precaricato.
Collegare un tubo di perfusione alla camera. Individua i corpi dei funghi fluorescenti, concentrandoti sul calice e sui lobi mediali. Confermare il drenaggio con il tampone. Impostare
i parametri di imaging e concentrarsi sul calice e sui lobi mediali. Al buio, acquisire immagini a fluorescenza di base dei corpi dei funghi prima dell'esposizione agli stimolanti.
Perfondere la nicotina nel tampone contenente calcio per attivare i recettori nicotinici dell'acetilcolina, innescando l'afflusso di calcio e l'emissione di luce bioluminescente.
Perfondere il
cloruro di potassio per depolarizzare i neuroni, innescando il rilascio intracellulare di calcio e l'emissione di segnali bioluminescenti.
Lavare con tampone per ripristinare le condizioni basali.
Analizzare le immagini per valutare l'attività spaziale e temporale del calcio nel calice e nei lobi mediali.
- Quindi, posizionare il campione sulla montatura sotto il microscopio e regolare l'ingrandimento su 5x. Quindi, inserire il tubo di perfusione nel canale attraverso la puntura. Impostare il microscopio in modalità fluorescente, quindi centrare e mettere a fuoco i corpi dei funghi. Una volta che i corpi dei funghi sono a fuoco, cambia l'ingrandimento a 20x. Centra nuovamente l'immagine e regola la messa a fuoco.
Quindi, posizionare l'apparato di drenaggio sopra la piscina di drenaggio e regolare l'altezza dello shunt di drenaggio in modo che la punta sia appena sopra la piscina di drenaggio. Quindi, sciacquare il campione con la soluzione di Ringer per 30 secondi per verificare l'adeguato drenaggio. Infine, abbassare lo schermo per sigillare l'apparecchio da qualsiasi luce esterna.
Utilizzando il sistema automatizzato del programma Photon Imager, è possibile effettuare regolazioni fini della messa a fuoco e scattare un'immagine fluorescente di riferimento dei corpi dei funghi. Regola la posizione delle caselle della regione di interesse sopra il calice, i corpi cellulari e i lobi mediali facendo clic sulle caselle e trascinandole in posizione tenendo premuto il tasto Ctrl.
Ora, registra i valori di base per circa 5-10 minuti. Quindi, accendi l'interruttore per iniziare il flusso di nicotina. Allo stesso tempo, premi Invio e aggiungi una nota per indicare che il flusso di nicotina è iniziato. Dopo un minuto, interrompere il flusso e inserire un'altra nota nel registro che indica che il flusso è stato interrotto. Quindi, lavare il campione con la soluzione di Ringer per cinque minuti.
Mentre il campione si riprende, spegnere il lavaggio, impostare il timer per altri cinque minuti e prepararsi ad avviare il flusso di cloruro di potassio. Quando si è pronti per iniziare, avviare il flusso di cloruro di potassio e inserire 100 millimolari di cloruro di potassio nel registro del campione. Dopo un minuto, interrompere il flusso e inserire il cloruro di potassio chiuso nel registro del campione. Quindi, lavare il campione con la soluzione di Ringer per un minuto e passare il microscopio in modalità fluorescente. Scattare un'ultima immagine fluorescente, quindi spegnere la soluzione di Ringer e rimuovere il campione.