Ablazione neuronale mirata mediante microscopia a due fotoni in una larava di pesce zebra

Iniziare con una larva di pesce zebra transgenica anestetizzata immobilizzata nell'agarosio e posta in una capsula di Petri contenente una soluzione anestetica.

Posizionalo sotto un microscopio laser a due fotoni, che utilizza due fotoni per l'imaging dettagliato.

Concentrati sugli strati superiore e inferiore del cervello per stabilire i limiti dell'imaging.

Cattura immagini a varie profondità per osservare i neuroni prima del trattamento laser.

Regola la messa a fuoco sulla regione di interesse e regola le dimensioni del fotogramma per perfezionare la messa a fuoco sui neuroni.

Seleziona e irradia i neuroni utilizzando il laser a due fotoni.

Il laser induce calore localizzato, con conseguente morte neuronale con danni minimi ai tessuti circostanti. Cattura l'immagine.

Confronta le immagini pre e post-trattamento per valutare le variazioni della fluorescenza.

Rifocalizzare i neuroni su piani più profondi e ripetere l'irradiazione per trattare tutti i neuroni nella regione di interesse.

Acquisire nuovamente l'immagine e confrontarla con l'immagine di pre-trattamento. La perdita di fluorescenza dopo il trattamento laser conferma il successo dell'ablazione neuronale.

Posizionare la larva inclusa nell'agarosio sotto un microscopio a scansione laser a 2 fotoni e avviare il sistema di microscopia. Aprire il software di acquisizione delle immagini e, nella scheda Laser, fare clic sul pulsante di accensione per accendere il laser. Attendere che lo stato del laser cambi da Occupato a Modalità bloccata.

Nella scheda Canali, impostare la lunghezza d'onda del laser su 880 nanometri per l'ablazione EGFP o 800 nanometri per l'ablazione GcAMP. Seleziona l'obiettivo 20x spostando manualmente il revolver dell'obiettivo. Quindi, fai clic sulla scheda Individua. Fare clic su GFP per modificare i percorsi ottici e visualizzare direttamente la fluorescenza a occhio. Centrare il cervello larvale del pesce zebra nel campo visivo. Quindi, fare clic sulla scheda Acquisizione per tornare alla microscopia a due fotoni e impostare la potenza e il guadagno del laser.

Come registrazione della condizione prima dell'ablazione, fare clic su Z-Stack per selezionare l'opzione Z-Stack. Quindi, dopo esserti concentrato sull'estremità ventrale del cervello larvale, fai clic sul pulsante Imposta prima per impostare il limite inferiore. E dopo esserti concentrato sulla superficie più dorsale del cervello, fai clic sul pulsante Imposta ultimo per impostare il limite superiore. Infine, fai clic sul pulsante Avvia esperimento per eseguire l'acquisizione dell'immagine Z-Stack.

Quindi, seleziona l'obiettivo 63x spostando manualmente il revolver dell'obiettivo. Quindi, fare clic sulla scheda Individua per passare alla microscopia a epifluorescenza. Centrare le cellule da ablare ad occhio. Quindi, fare clic sulla scheda Acquisizione per tornare alla microscopia a scansione laser.

Nella scheda Modalità di acquisizione, impostare la dimensione del fotogramma su 256 x 256. Fai clic su Live e osserva i neuroni di interesse. Quindi, partendo dal lato più dorsale, trova un piano focale in cui le cellule da ablare siano a fuoco. Utilizzando la funzione Regioni, contrassegna una piccola area circolare di circa un terzo della dimensione della cellula in diametro su ciascun neurone come ROI.

Impostare la velocità di scansione su 13,93 secondi per 256 x 256 pixel, che corrisponde a un tempo di permanenza del laser di circa 200 microsecondi per pixel o 200 microsecondi per mezzo micron. Inoltre, imposta il ciclo di iterazione su 4 ripetizioni. Fare clic su Avvia esperimento per eseguire le funzioni di serie temporale e sbiancamento. Confrontare l'immagine prima dell'ablazione con l'immagine dopo l'ablazione nel ciclo delle serie temporali, per garantire che la fluorescenza nelle cellule bersaglio sia scomparsa.

Quindi, sposta il piano focale leggermente più in profondità e scegli il piano focale successivo in cui compaiono le cellule non ablate. Eseguire la funzione di sbiancamento come appena dimostrato e ripetere il processo fino a quando tutte le cellule della struttura neurale di interesse sono state ablate. Dopo l'ablazione, controllare che le cellule non siano fluorescenti abolite e, se necessario, ripetere l'irradiazione laser.