Imaging a fluorescenza dell'aggregazione della proteina PolyQ nei neuroni di Caenorhabditis elegans

Iniziare con i vermi Caenorhabditis elegans anestetizzati, di pari età e con deficit di chaperone.

Entrambi i gruppi esprimono proteine polyQ marcate con fluorofori nei loro neuroni che sono inclini a ripiegarsi erroneamente.

Nei vermi di controllo, le proteine chaperone limitano l'aggregazione di polyQ mal ripiegata, mentre, nei vermi carenti di chaperone, il polyQ mal ripiegato forma facilmente aggregati.

Posizionare il vetrino di controllo su un tavolino confocale per microscopia per la microscopia FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy).

Illuminare i vermi utilizzando un laser pulsato.

Il laser eccita il fluoroforo, che emette un fotone quando ritorna allo stato fondamentale.

FLIM misura la durata della fluorescenza, ovvero la durata in cui il fluoroforo rimane nel suo stato eccitato.

Nei vermi carenti di chaperone, l'aggregazione polyQ raggruppa i fluorofori, promuovendo il trasferimento di energia tra fluorofori adiacenti invece dell'emissione di fotoni, riducendo così la durata della fluorescenza.

Il software FLIM elabora queste durate per generare mappe codificate a colori, consentendo la visualizzazione dell'aggregazione.

Una ridotta durata della fluorescenza nei vermi carenti di chaperone, rispetto ai controlli, indica un aumento dell'aggregazione di polyQ.

Assicurati che i nematodi siano completamente immobili. Aprire il software di acquisizione FLIM. Individua il pulsante Tab e premi Abilita uscite. Posizionare il vetrino con il C. elegans montato sul tavolino e, utilizzando una lente di ingrandimento 10x in modalità di trasmissione, localizzare la posizione dei nematodi sul vetrino. Rimuovere il vetrino, passare l'obiettivo a una lente con ingrandimento 63 volte e applicare il mezzo di immersione richiesto.

Posizionare il vetrino sul tavolino e localizzare i nematodi. Avviare la scansione del campione. Selezionare una regione di interesse e concentrarsi sul suo piano di proiezione massimo. Sull'interfaccia del software FLIM, visualizzare in anteprima il numero di fotoni rilevati. Il valore ADC dovrebbe essere compreso tra 1 volte 10 per il quarto e 1 per 10 per il quinto. Se necessario, spostare la messa a fuoco su un piano diverso o aumentare la potenza del laser per raccogliere più fotoni.

- Assicurati di evitare l'accumulo di fotoni, ma raccogli una quantità sufficiente di fotoni per creare un buon adattamento e misurazione della durata.

- Nella barra dei menu, selezionare la scheda per impostare i parametri di acquisizione. Selezionare Sincronizza scansione in per consentire il rilevamento di un singolo fotone. Impostare l'acquisizione su un periodo di tempo fisso o su un numero fisso di fotoni. Premere Avvia per avviare l'acquisizione. Apri il software e importa i file di dati FLIM tramite File, Carica dati FLIM. Caricare tutti i campioni da una sola condizione, anche se ottenuti in sessioni diverse e da ripetizioni biologiche diverse.

Se necessario, segmentare un singolo nematode per molte immagini FLIM tramite Segmentazione, Gestione segmentazione. Trascina lo strumento di ritaglio intorno all'area di interesse finché non viene evidenziata. Una volta completato, premere OK. Selezionare una piccola regione in cui appare l'immagine basata sull'intensità di un C. elegans. La curva di decadimento di quella regione appare nella grande finestra di decadimento sul lato destro dell'interfaccia.

Per estrapolare la durata nella scheda Dati, impostare un valore minimo integrato arbitrario compreso tra 40 e 300 per escludere i pixel troppo scuri per produrre un buon adattamento. Selezionare un numero di tempo minimo e un numero massimo di tempo per limitare il segnale FLIM a questi valori. Non modificare i conteggi preimpostati fotone di uno. Inserire la frequenza di ripetizione in megahertz del laser utilizzato durante l'acquisizione.

Immettere un valore massimo di gate per escludere tutti i pixel saturi. Nella scheda Durata (Lifetime), selezionate un raccordo globale da utilizzare. Non modificare nessun altro parametro tranne il numero di selezione esponenziale se è noto che il decadimento della fluorescenza scelto è multiesponenziale e mostra più di una singola durata.

Carica l'IRF tramite il menu IRF. Per stimare lo spostamento IRF, selezionare IRF, Stima, Spostamento IRF. Nella scheda IRF viene visualizzato automaticamente un insieme di valori. Una volta stabilito ciò, non modificare altri parametri di questa scheda. Una volta impostati tutti i parametri, premere Adatta set di dati. L'adattamento risultante evidenziato in una linea blu deve sovrapporsi a tutti gli eventi. Un buon adattamento si ottiene quando tutti gli eventi sono allineati lungo l'adattamento.

Fare clic sulla scheda Parametri situata nei menu in alto a destra dell'interfaccia del software, selezionare la statistica, la media ponderata e verificare che il valore del chi-quadrato sia il più vicino possibile a uno. Il lifetime value dell'immagine selezionata viene quindi rivelato come tau 1. Esporta tutte le informazioni di interesse tramite File, Esporta immagini di intensità, Adatta tabella risultati, Immagini, Istogrammi.