Imaging di cellule vive della migrazione nucleare gliale di Muller durante la rigenerazione retinica del pesce zebra

Iniziare con un espiante di retina dorsale incorporato in agarosio da un pesce zebra transgenico, montato in un fluoropiatto con terreno.

La retina mostra un danno ai fotorecettori indotto dalla luce e contiene cellule gliali di Muller o MGC con nuclei che esprimono GFP.

Posizionare il piatto in una camera per microscopio multifotone.

Utilizzando l'illuminazione a campo chiaro, concentrarsi sulla retina.

Passa alla modalità di fluorescenza per localizzare gli MGC.

Configura uno z-stack dallo strato di celle gangliari o GCL allo strato nucleare esterno o ONL.

Avvia l'imaging dal vivo.

I fotorecettori danneggiati rilasciano TNF-α, attivando le MGC.

I nuclei di MGC migrano basalmente all'interno dello strato nucleare interno o INL per replicare il loro DNA.

Quindi, i nuclei migrano apicalmente verso l'ONL per andare incontro a mitosi, producendo progenitori neuronali.

Dopo la mitosi, i nuclei e i progenitori MGC migrano basalmente verso l'INL.

I progenitori proliferano, migrano verso il sito della lesione e si differenziano in fotorecettori, consentendo la rigenerazione retinica.

Analizza le immagini acquisite per visualizzare la migrazione nucleare.

Nel software di acquisizione delle immagini, aprire le finestre A1 MP GUI, TiPad, A1 Compact GUI e ND Acquisition. Per l'imaging multifotone, assicurarsi che l'opzione IR NDD sia selezionata nella finestra GUI compatta A1. Quindi, nel campo di impostazione, selezionare IR-DM per il primo specchio dicroico e verificare che il filtro passa-banda sia impostato da 525 a 50 per acquisire la fluorescenza GFP.

Quindi, accendi il laser IR nella finestra GUI A1 MP. Ci vorranno alcuni minuti prima che il laser sia pronto. Successivamente, impostare la lunghezza d'onda su 910 nanometri per eccitare la fluorescenza GFP e allineare il laser facendo clic sul pulsante Allineamento automatico.

Dopo aver posizionato la coltura retinica sul tavolino del microscopio multifotone, assicurarsi che le luci della stanza e dell'apparecchiatura siano spente prima di aprire l'otturatore per evitare la sovraesposizione del tubo fotomoltiplicatore. Per ridurre i livelli di rumore, collocare il microscopio in un ambiente buio.

Acquisire immagini di un campo visivo di 300 x 300 pixel con uno zoom di 2, impostato nella finestra Area di scansione, e un tempo di permanenza dei pixel di 4,8 microsecondi per pixel scelto nella finestra GUI di A1 Compact. Impostare approssimativamente la potenza del laser modificando l'area di acquisizione nella finestra dell'interfaccia grafica A1 MP e il guadagno nella finestra dell'interfaccia grafica A1 Compact.

Ora, concentrati sullo strato di cellule gangliari e imposta il piano focale superiore dello z-stack nella sottofinestra Z all'interno della finestra di acquisizione ND. Spostare il piano focale attraverso il livello dello strato nucleare esterno, che è caratterizzato dalla presenza di celle GFAP e GFP-positive debolmente etichettate che sono rotonde e ingrandite rispetto alle loro controparti nello strato nucleare interno.

Impostate questo piano come parte inferiore dello z-stack. Quindi, imposta la dimensione del passo z tra 0,7 e 1 micrometro. Per impostare la correzione dell'intensità z, aprire la finestra Correzione intensità Z e scegliere Da ND per impostare l'intervallo z-stack. Quindi, fare clic sul piano focale inferiore nella finestra Correzione intensità Z e impostare l'intensità e il guadagno del laser.

Successivamente, fare clic sulla freccia accanto ai valori z nella finestra Correzione intensità Z per confermare le impostazioni che vengono successivamente visualizzate in Impostazioni dispositivo nella finestra Correzione intensità Z per il piano focale scelto. Ripetere il processo per i piani centrale e superiore, aumentando la potenza e il guadagno del laser.

Impostare l'area di acquisizione nella finestra dell'interfaccia grafica A1 MP ed evitare di selezionare un'area di acquisizione maggiore di 15 e un guadagno superiore a 126 all'inizio dell'imaging per aggirare il photobleaching e l'aumento dei livelli di rumore. Successivamente, scegliere la correzione dell'intensità relativa nella finestra Correzione intensità Z. Nella finestra secondaria della serie temporale della finestra di acquisizione ND, impostare la durata su otto ore e l'intervallo su nessun ritardo. Quindi, fare clic su Esegui correzione Z nella sottofinestra Z-Stack della finestra Acquisizione ND per acquisire serie temporali 3D.