JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:43 min. • June 18th, 2025
Prendi una piastra a più pozzetti contenente cellule staminali neurali aderenti o NSC isolate da un cervello di topo transgenico. Queste NSC contengono una proteina marcata in fluorescenza che è specifica per la prima fase di crescita, o G1.
Quando l'NSC si divide, diventa fluorescente nella fase G1 del ciclo cellulare mentre non emette fluorescenza nelle altre fasi.
Posizionare la piastra in una camera di imaging per microscopio a scansione laser confocale, mantenuta a temperatura controllata.
Selezionare l'obiettivo desiderato e regolare l'intensità della fluorescenza.
Configurare i parametri per l'imaging time-lapse.
Scegli l'opzione dell'immagine grande e programma l'acquisizione delle immagini a intervalli regolari per la durata desiderata.
Utilizzare uno scanner risonante ad alta velocità per evitare il fotosbiancamento e mantenere un'alta risoluzione.
Utilizzare l'impostazione del campo chiaro per visualizzare la forma della cellula e utilizzare un filtro fluorescente appropriato per catturare la fluorescenza.
Avviare l'imaging time-lapse dell'NSC per visualizzare le diverse fasi del ciclo cellulare.
Preparare un microscopio a scansione laser confocale per l'imaging preriscaldando la camera di controllo della temperatura collegata a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica del 5%. Posizionare la piastra a 96 pozzetti all'interno della camera del microscopio preriscaldata e mettere a fuoco il primo pozzetto. Quindi, aprire il software di imaging e fare clic con il pulsante destro del mouse nella finestra principale per selezionare Acquisisci controlli di acquisizione e deacquisizione per aprire il TI Pad e selezionare l'obiettivo DIC piano Apo VC 20x.
Quindi, fai clic su Acquisisci controlli di acquisizione, quindi apri le opzioni time lapse. Impostate il centro di ogni pozzetto come posizione del tavolino e selezionate l'opzione Immagine grande su 7 x 7 millimetri quadrati. Osserva un'immagine a mosaico attorno al centro di ogni pozzo. Imposta la sovrapposizione per l'immagine a mosaico grande al 5% e imposta la frequenza in modo che le foto vengano scattate ogni 20 minuti per 24 ore.
Nelle impostazioni A1 plus, selezionare il livello di tensione del tubo fotomoltiplicatore per ogni fluorescenza elencata nella barra dei menu. Selezionare questa opzione per acquisire le immagini utilizzando uno scanner risonante ad alta velocità in formato 512 x 512 pixel e utilizzare DIC per visualizzare le celle. Quindi, seleziona la cartella in cui salvare i file di dati. Selezionare il pulsante Esegui ora nella finestra di acquisizione ND per avviare l'acquisizione.