Imaging di seconda generazione armonica in un modello di ratto per studiare i difetti della tubulina

Inizia con una fetta di tessuto cerebrale di ratto montata su un vetrino e immersa in un tampone.

Il ratto soffre di tubulinopatia, una condizione causata da difetti nella tubulina, gli elementi costitutivi dei microtubuli, che portano al loro accumulo e rottura anormali.

Ciò influisce anche sulla produzione di mielina nel sistema nervoso centrale.

Posizionare la fetta sotto un microscopio a eccitazione a due fotoni coperto per ottenere immagini dettagliate.

Idratare regolarmente la fetta per mantenerne l'integrità.

Impostare il microscopio su una modalità di imaging non descansionata, una tecnica senza etichetta per rilevare segnali deboli.

Esporre il tessuto a un laser a infrarossi pulsati.

I microtubuli emettono luce come segnali rilevabili noti come generazione di seconda armonica o segnali SHG.

Le aree con accumulo anomalo di microtubuli amplificano questi segnali, aumentandone la rilevabilità.

Applica filtri ottici per perfezionare questi segnali.

L'immagine catturata rivela densità e anomalie dei microtubuli, in cui l'elevata intensità di SHG e il raggruppamento indicano difetti di tubulina e ridotta produzione di mielina.

Posizionare il campione sotto il microscopio e posizionarlo opportunamente sotto l'obiettivo mediante osservazione diretta attraverso gli oculari a luce trasmessa. Rimuovere l'HBSS in eccesso in modo che una sottile pellicola liquida copra l'intero campione. Controllare visivamente il film liquido ogni pochi minuti per evitare un'eccessiva evaporazione e asciugatura del campione.

Preparare il tavolino del microscopio per l'imaging non descansionato, che include la chiusura di tutte le porte della camera di incubazione scura o la copertura della camera di incubazione con un tessuto rivestito in nylon poliuretanico nero. Selezionare la modalità di imaging non descansionato lungo il percorso di trasmissione. In questo modo, la cattura del debole segnale SH della tubulina sarà ottimizzata.

Quindi seleziona l'obiettivo. Quindi, imposta una potenza laser con un tempo di permanenza dei pixel di 12,6 microsecondi. Scatta immagini non più grandi di 512 x 512 pixel, con velocità 5 e media 2 per un tempo medio di acquisizione di 15 secondi. Acquisisci prima le immagini utilizzando un filtro passa corto da 485 nanometri. E in una seconda fase, aggiungi un filtro passa-banda affilato a 405 nanometri.