JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:15 min • June 17th, 2025
Iniziare con un espianto di retina di topo postnatale vivo montato su un filtro a membrana e posto in una camera di incubazione al microscopio confocale.
La retina viene trasfettata per esprimere una proteina fluorescente nelle membrane degli interneuroni amacrini starburst.
Posizionare un peso del campione pre-bagnato sulla retina per stabilizzarla.
Riempire la camera con il tampone.
Mantenere il flusso e la temperatura ottimali del tampone nella camera per preservare la vitalità neuronale.
Posizionare un obiettivo a immersione in acqua nella camera di imaging.
Avviare l'imaging a epifluorescenza.
La luce laser, diretta attraverso l'obiettivo, eccita la proteina fluorescente nelle cellule amacrine.
La fluorescenza emessa viene catturata attraverso lo stesso obiettivo, consentendo la visualizzazione delle cellule amacrine marcate.
Identificare una cella fluorescente per l'imaging.
Impostare i parametri di imaging.
Acquisisci immagini su più piani Z per ottenere una visualizzazione 3D della morfologia dendritica completa.
Esegui l'imaging time-lapse per tenere traccia dei cambiamenti nella morfologia dendritica nel tempo.
Assemblare la camera di incubazione per immagini dal vivo e riempirla con aCSF ossigenato. Accendere la pompa e il termoregolatore, assicurandosi che la temperatura non superi i 34 gradi Celsius. Può essere necessaria fino a un'ora prima che la temperatura della camera si stabilizzi. Si consiglia di allestire la camera di incubazione prima di iniziare la dissezione retinica. La temperatura stabile della camera aiuta a ridurre la deriva del campione.
Per trasferire il tumulo piatto retinico nella camera di perfusione, arrestare la pompa e rimuovere l'aCSF che si trova nella camera. Quindi, posizionare il disco MCE con la montatura piatta retinica nella camera di incubazione. Pre-bagnare un peso del campione per rompere la tensione superficiale, quindi posizionarlo sul tumulo piatto, assicurandosi che il peso del campione sia posizionato sulla carta MCE per ridurre la deriva del campione. Riempire la camera con l'aCSF riscaldato e far circolare l'aCSF a circa 1 millilitro al minuto.
Posizionare il nasello con l'obiettivo a immersione 25 volte nell'acqua nella camera di imaging. Screening delle cellule di interesse marcate utilizzando la luce epifluorescente e regolazione del volume di imaging per catturare le caratteristiche dendritiche di interesse.
Utilizzando una tabella di ricerca che identifichi sia i pixel sovrasaturi che quelli sottosaturi, regolare la potenza del laser in modo che nessun pixel sia sovrasaturo. Acquisisci il volume di imaging 3D e ripeti l'acquisizione alla frequenza dei fotogrammi desiderata. Il volume dell'imaging può essere regolato tra ogni punto temporale per compensare la deriva del campione.