JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:23 min • June 17th, 2025
Prendete una co-coltura di glia immortalizzata dell'olfatto umano, o cellule OEG, e neuroni gangliari retinici di ratto assotomizzati, o RGN, su un vetrino coprioggetti.
Le cellule OEG mostrano proprietà neurorigenerative che facilitano la rigenerazione assonale nelle RGN.
Gli RGN sono immunomarcati in modo che i loro somi, o corpi cellulari, emettano una fluorescenza rossa mentre i loro assoni emettono fluorescenza verde.
Utilizzando i supporti di montaggio, montare il vetrino coprioggetti contenente le cellule.
Utilizzare un microscopio a epifluorescenza per acquisire più immagini di RGN.
Aprire un'immagine nel software di imaging.
Quantifica la percentuale di neuroni con gli assoni rispetto al numero totale di RGN.
Quindi, traccia un assone partendo dal soma fino alla fine e inizia il tracciamento degli assoni per determinare le lunghezze di tutti gli assoni.
Quantificare l'indice di rigenerazione assonale dividendo la somma di tutte le lunghezze assonali per il numero totale di RGN.
Montare i vetrini coprioggetti con il mezzo di montaggio e mantenerli a 4 gradi Celsius. Utilizzare un obiettivo 40 volte di un microscopio a epifluorescenza per quantificare la rigenerazione assonale. Quantificare la percentuale di neuroni con assoni rispetto alla popolazione totale di neuroni gangliari retinici.
Utilizza il plug-in NeuronJ in ImageJ per quantificare l'indice di rigenerazione assonale, o lunghezza assonale media, che è la somma delle lunghezze di tutti gli assoni identificati divisa per il numero totale di neuroni contati, indipendentemente dal fatto che abbiano presentato un assone o meno. Dopo aver aperto l'immagine, fare clic su Analizza e impostare la scala in base alle impostazioni del microscopio, lavorando in pixel per micrometro. Selezionare Aggiungi tracciamenti per iniziare il tracciamento degli assoni, quindi tenere traccia degli assoni dal soma alla fine. Fare clic su Misura tracciamenti, visualizzare le misurazioni di tracciamento ed Esegui.