JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
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Inizia con un uovo di gallina fecondato contenente un embrione in fase iniziale con il suo tubo neurale asportato a livello dei somiti da uno a sette.
Prelevare un tubo neurale del donatore marcato con GFP da un embrione di pollo transgenico compatibile con lo stadio e impiantarlo nel ricevente, garantendo un corretto orientamento anatomico.
Rimuovere il liquido in eccesso intorno all'innesto per migliorare l'adesione tra il donatore e i tessuti dell'ospite.
Sigillare la finestra con nastro adesivo trasparente per evitare disidratazione e contaminazione.
Incubare l'uovo fino a quando l'embrione non si sviluppa allo stadio desiderato.
Rimuovere il nastro adesivo.
Identificare una vena vitellina sul tuorlo che trasporta il sangue verso l'embrione e rimuovere la membrana vitellina sovrastante.
Usando un ago di vetro, iniettare costantemente un colorante fluorescente lipofilo nella vena.
Visualizzare l'embrione al microscopio a stereofluorescenza.
Il colorante iniettato si lega alle cellule endoteliali che rivestono i vasi sanguigni, evidenziando la rete vascolare, mentre il tubo neurale marcato con GFP consente il tracciamento della rete neurale.
Quando sei pronto per iniziare la procedura di innesto, trasferisci con cura il tubo neurale sezionato dal vetro dell'orologio all'embrione ospite. Posizionare il tubo neurale con l'orientamento corretto. E spingere delicatamente l'espiante adiacente nella regione asportata. Se necessario, utilizzare il micro bisturi per tagliare l'espiante alla dimensione esatta della regione asportata.
Una volta nella posizione corretta, rimuovere il PBS e altri liquidi per aiutare i tessuti del donatore e dell'ospite ad aderire e stabilire l'innesto. Il successo dell'integrazione del tubo neurale GFP positivo innestato nell'ospite di pollo wild type può essere valutato al microscopio a fluorescenza. Sigilla l'intera finestra con nastro trasparente largo 24 millimetri per prevenire la disidratazione e la contaminazione.
Etichetta l'embrione chimerico. E rimetti l'uovo nell'incubatrice per un ulteriore sviluppo.
Al momento sperimentale desiderato, recuperare l'ovulo dall'incubatrice. E rimuovi il nastro trasparente per accedere all'embrione. Una volta visibile, individua una vena accessibile sul tuorlo, assicurandoti che il flusso sanguigno sia diretto verso l'embrione.
Scegliere un punto di ramificazione su una delle vene vitelline per la posizione di iniezione. Utilizzare una pinzetta per rimuovere la membrana vitellina sopra il punto di iniezione scelto strappandola in direzioni opposte. Quindi, regola il diametro di un ago di vetro tirato in base alle dimensioni della vena.
Caricare l'ago con 5-10 microlitri di soluzione DiI. Inserire rapidamente l'ago nella vena. E soffiare costantemente con il tubo della bocca per consentire al DiI di unirsi lentamente al flusso sanguigno senza formare un coagulo. Il successo dell'iniezione DiI può essere valutato osservando brevemente l'embrione al microscopio a fluorescenza.