$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Prendete una capsula di imaging con fondo di vetro contenente neuroni corticali embrionali di topo.
Posizionare la capsula all'interno della camera ambientale di un microscopio a contrasto di interferenza differenziale, o DIC, per mantenere la vitalità cellulare durante l'imaging.
La microscopia DIC divide la luce polarizzata in due fasci che attraversano il campione.
Le variazioni dell'indice di rifrazione attraverso il campione introducono sfasamenti tra questi raggi.
Quando i fasci si ricombinano, la loro interferenza genera un'immagine ad alto contrasto, rendendo visibili le strutture cellulari più fini.
Identifica i neuroni con assoni non ramificati e utilizza l'imaging time-lapse per visualizzare la ramificazione assonale.
Trattare con netrina-1, un segnale di guida extracellulare che si lega ai recettori assonali e innesca l'esocitosi localizzata.
Le vescicole esocitiche trasportano i componenti della membrana ai siti mentre il citoscheletro viene riorganizzato per supportare l'espansione della membrana.
Al microscopio, questi cambiamenti appaiono come piccole sporgenze, che segnano l'inizio della ramificazione assonale.
Nel tempo, queste sporgenze si sviluppano in rami assonali maturi, illustrando il processo dinamico dello sviluppo neuronale.
Dopo due giorni in vitro, posizionare la capsula di imaging con fondo di vetro contenente neuroni non trasfettati in una camera ambientale umida pre-riscaldata. Utilizza un microscopio dotato di un apocromatico piano 60x, obiettivo DIC da 1,4 NA e un condensatore ad alta apertura numerica per la migliore qualità e risoluzione dell'immagine. Successivamente, con l'illuminazione a luce trasmessa, regolare il piano focale per trovare i neuroni attraverso gli oculari.
Per l'imaging DIC della ramificazione degli assoni, la corretta impostazione dell'illuminazione del dispositivo di raffreddamento sarà fondamentale per l'ottimizzazione dell'immagine ed è fondamentale per produrre risultati analizzabili. Quindi, con i neuroni di interesse all'interno del campo visivo, utilizzare la funzione di acquisizione multi-area nel software di imaging per trovare e salvare le posizioni XYZ di almeno sei cellule. Ora, aggiungere a una concentrazione finale di 250 nanogrammi per millilitro di netrina-1 o altro fattore di interesse per stimolare le cellule e premere Avvia acquisizione multi-area.
In sequenza, acquisisci le immagini in ogni posizione ogni 20 secondi per 24 ore, mettendo in pausa l'acquisizione e rimettendo a fuoco se necessario. All'interno del software di imaging, rivedere le immagini scegliendo App, Rivedi dati multidimensionali e aprire il file desiderato. Identificare i rami stabili degli assoni che si formano durante la sessione di imaging. Utilizzare lo strumento regione di traccia per misurare un ramo stabile dell'assone dalla base dell'assone alla punta.