Generation teratoma nella Capsule Testicolo

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la pluripotenza generando teratomi nella capsula testicolare di topi immunodepressi utilizzando cellule staminali pluripotenti umane o H PSCs. Iniziare prelevando una coltura delle H PSCs putative da testare per la pluripotenza. Successivamente, eseguire un intervento chirurgico per esporre i testicoli del topo e iniettare le cellule nella capsula testicolare.

Riposizionare i testicoli nella loro sede originale e chiudere chirurgicamente il dorso del topo; dopo sei-dodici settimane, esaminare il tumore risultante mediante istologia per verificare la presenza di cellule provenienti da ciascuno dei tre strati germinativi. In definitiva, i risultati possono dimostrare che una linea di cellule staminali pluripotenti umane è effettivamente pluripotente mostrando la capacità di differenziarsi in cellule derivanti dai tre strati germinativi in un topo immunocompromesso. Sebbene siano stati recentemente descritti nuovi metodi per dimostrare la pluripotenza delle cellule staminali umane, il saggio del teratoma rimane lo standard di riferimento nel campo. La procedura sarà eseguita da Tron, tecnico senior del mio laboratorio.

Coltivare le cellule staminali pluripotenti umane fino a confluenza, quindi dissociare gli HPSC con Accutase e contare le cellule per risospendere 1 milione di cellule progenitrici ematiche per iniezione. Prima rasare l'addome di topi maschi anestetizzati di sei settimane di un ceppo di topo immunocompromesso utilizzando un rasoio elettrico. Pulire la parete anteriore dell'addome del topo con soluzione di iodopovidone, partendo dal centro dell'addome e procedendo in senso orario verso l'esterno.

Quindi lavare l'area rasata con etanolo al 70%. Ripetere il procedimento tre volte, cambiando i tamponi ogni volta. Per eseguire l'intervento chirurgico, trasferire l'animale su un tappetino riscaldante all'interno di una cappa sterile con forbici chirurgiche sterili.

Eseguire un'incisione longitudinale di un centimetro attraverso la cute e il peritoneo appena al di sotto del livello dell'articolazione dell'anca, tenendo il peritoneo con una pinzetta. Raggiungere con un'altra coppia di pinzette sterili l'anca destra ed estrarre il tessuto adiposo bianco insieme ai testicoli ad esso collegati. Riempire ora una siringa tubercolinica da un CC con le hpsc da iniettare. Iniettare lentamente da 20 a 30 microlitri di H PSCs al centro della capsula testicolare, lontano da qualsiasi vaso sanguigno principale.

Rimuovere lentamente l'ago per evitare il reflusso delle cellule utilizzando pinzette. Riposizionare i testicoli e il tessuto adiposo nella loro posizione originale nell'addome. Chiudere il peritoneo con due o tre suture riassorbibili e chiudere la pelle con clip autoadesive.

Dopo l'intervento chirurgico, somministrare l'analgesia due volte al giorno secondo necessità. Monitorare l'animale per rilevare la crescita tumorale palpabile nel corso di sei-dodici settimane. Quando il tumore raggiunge una dimensione di circa cinque millimetri, rimuoverlo dal topo sacrificato ai fini della documentazione.

Fotografare il tumore e misurarne le dimensioni e il peso. Quindi tagliare il tumore in piccoli pezzi e fissarli in soluzione di paraformaldeide al 4% per l'analisi istopatologica. Tipicamente, un teratoma viene osservato dopo sei-dodici settimane.

In questo esempio, 1 milione di cellule staminali pluripotenti umane WA oh nove sono state iniettate nella capsula testicolare di un topo immunocompromesso. Un esame accurato del teratoma rivela eterogeneità e numerosi cisti adesi. Come previsto.

Le analisi istopatologiche indicano la presenza di cellule appartenenti a ciascuno dei tre strati germinativi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di includere una linea cellulare di controllo positivo che si sa essere piuttosto potente, per assicurarsi che il saggio sia stato eseguito correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere un'idea chiara di come determinare se una linea di cellule staminali umane è pluripotente oppure no.