Quantificazione delle spine dendritiche mediante imaging al microscopio confocale

Prendiamo i neuroni piramidali che vengono trasdotti e immunomarcati per diventare verdi fluorescenti.

Acquisisci immagini dei neuroni utilizzando un microscopio a scansione laser confocale con impostazioni regolate per garantire una qualità dell'immagine ottimale.

Apri un'immagine utilizzando un software specializzato e usa il filtro gaussiano per ridurre il rumore di fondo.

Eseguire il tracciamento semiautomatico dei dendriti stimando prima il diametro dei dendriti. Quindi, seleziona il punto iniziale, il percorso e il punto finale del dendrite.

Per la segmentazione automatica della colonna vertebrale, selezionare Ricostruisci diametro dendrite e impostare la soglia del volume dendritico in modo che rappresenti il volume effettivo del dendrite.

Specificare i valori per il diametro più piccolo della testa della spina dorsale e la lunghezza massima della spine.

Regola la soglia per i punti che rappresentano le spine, assicurandoti che siano localizzate sulle teste delle spine reali.

Imposta i parametri per classificare le spine in base alla lunghezza, al diametro della testa e alla forma.

Genera un modello 3D del dendrite con spine ed esporta i dati per ulteriori analisi.

Al microscopio confocale, selezionare almeno 10 neuroni sani per condizione con una morfologia piramidale e un'arborizzazione dendritica completa. Per quantificare da 60 a 100 micrometri per dendrite, acquisire immagini con un obiettivo a olio 40x, NA 1.3 e un laser a 488 nanometri con una potenza di picco tipica a livello di campione di circa 20 microwatt.

Impostare la dimensione dei pixel intorno a 80 nanometri per campionare correttamente le spine dendritiche. Per campionare l'intero volume del neurone, acquisire una pila Z con una spaziatura z da 150 a 300 nanometri, producendo da 20 a 30 fette z. Per eseguire la quantificazione 3D delle spine dendritiche, utilizzare le seguenti impostazioni per il software di analisi.

Per la pre-elaborazione, utilizzare il filtro gaussiano scegliendo Elaborazione immagini, Arrotondamento, Filtro gaussiano. Impostate la larghezza del filtro uguale alla dimensione dei pixel nel piano XY. Per eseguire un tracciamento semi-automatico dei dendriti, dal modulo tracciatore di filamenti nella scheda Slice, utilizzare lo strumento Distanza per stimare il diametro dei dendriti.

Successivamente, nella scheda Surpass, fai clic sullo strumento Filamenti e scegli Salta creazione automatica per una migliore robustezza. Nella scheda Disegna ora visualizzata, selezionare AutoPath come metodo, Dendrite come tipo e immettere il diametro stimato dei dendriti. Utilizzando la modalità di selezione del puntatore, ruotare il cursore in una casella, scegliere Maiusc e fare clic con il pulsante destro del mouse sul punto iniziale del dendrite. Il software eseguirà i calcoli iniziali.

Ora, sposta il puntatore lungo il dendrite. Dal punto di partenza, viene mostrata una linea gialla che rappresenta il percorso dei dendriti più probabile. Premere Maiusc e fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul punto finale del dendrite. Per eseguire la segmentazione automatica della colonna vertebrale, nell'interfaccia del modulo, fare clic sulla scheda Creazione. Nell'elenco a discesa Ricostruisci, scegliere Ricostruisci diametro dendrite e selezionare la casella Mantieni dati. Quindi fare clic su Ricostruisci.

Impostare la soglia in modo che il volume segmentato corrisponda al volume effettivo dei dendriti. Come algoritmo, selezionare la distanza più breve dalla mappa della distanza. Quindi fare clic sul pulsante Avanti. Nella scheda Sezione, determinare il diametro più piccolo della testa della colonna vertebrale e la lunghezza massima.

Quindi, nella scheda Surpass, inserisci i parametri. Valori intorno a 200-300 nanometri per il diametro minimo e 4 micrometri per la lunghezza massima sono buoni punti di partenza. Senza selezionare la casella Consenti dorso, fare clic sul pulsante Avanti.

Quindi, regolare la soglia dei punti di partenza in modo che i punti blu che rappresentano le spine si localizzino sulle teste delle spine effettive. Quindi fare clic su Avanti. Il calcolo di base verrà ora eseguito e può richiedere tempo. Per classificare le spine, nella scheda Strumenti dell'interfaccia del modulo, fare clic su Classifica spine.

Dopo aver verificato che ci siano quattro classi come indicato nel protocollo di testo, l'interfaccia del modulo genererà quattro nuovi oggetti filamento con i risultati della classificazione. Infine, esporta i dati statistici, nella scheda Statistiche facendo clic su Esporta tutte le statistiche su file.