Name: Fotolisi lampo di composti Caged nel Cilia di neuroni sensoriali olfattivi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Scopri la fotolisi lampo di composti caged per studiare la trasduzione olfattiva nei neuroni sensoriali del topo. Questo metodo di patch-clamp rivela l'attivazione dei canali gated da nucleotidi ciclici.

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<ol><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+compounds%3A+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).</li>
<li>Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+nucleotide-gated+ion+channels+in+sensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction.</a> FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).</li>
<li>Bozza, T. C., Kauer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+properties+of+convergent+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons.</a> J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).</li>
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<li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).</li>
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<li>Lagostena, L., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+and+photolysis+of+caged+compounds+in+olfactory+sensory+neurons+isolated+from+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse.</a> Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).</li>
<li>Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+adaptation+in+mouse+olfactory+sensory+neurons+does+not+require+the+activity+of+phosphodiesterase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase.</a> J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).</li>
<li>Boccaccio, A., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+development+of+cyclic+nucleotide-gated+and+Ca2%2B+-activated+Cl-+currents+in+isolated+mouse+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).</li>
<li>Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+concentration+jumps+reveal+dynamic+ion+selectivity+of+calcium-activated+chloride+currents+in+mouse+olfactory+sensory+neurons+and+TMEM16B-transfected+HEK+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells.</a> J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).</li>
<li>Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+Functional+Analysis+of+Ion+Channels+Heterologously+Expressed+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).</li>
<li>Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Responses+of+Mouse+Olfactory+Sensory+Neurons+Using+the+Air-phase+Electroolfactogram+Recording%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording.</a> J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).</li>
<li>Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+photolysis+using+a+light+emitting+diode%3A+an+efficient%2C+compact%2C+and+affordable+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution.</a> Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Flash fotolisi di composti in gabbia in combinazione con registrazioni patch-clamp è una tecnica utile per ottenere salti rapidi e locali della concentrazione di molecole attive fisiologicamente sia all&#39;interno che all&#39;esterno delle cellule. Diversi tipi di compounds1 in gabbia sono stati sintetizzati, e questa tecnica può essere applicata a diversi tipi di cellule, comprese le cellule in coltura esprimono canali ionici che possono essere attivate o modulata da fotolisi di alcuni dei composti disponibili in gabb...

<table border="1"><tbody><tr><th> Attrezzatura </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Adattatore modulo flash della lampada al microscopio </td><td> Rapp optoelettronici </td><td> FlashCube 70 </td><td></td></tr><tr><td> Air tavolo </td><td> TMC </td><td> MICRO-g 63-534 </td><td></td></tr><tr><td> Digitalizzatore </td><td> Axon Instruments </td><td> Digidata 1322A </td><td></td></tr><tr><td> Acquisizione Dati Software </td><td> Axon Instruments </td><td> pClamp 8 </td><td></td></tr><tr><td> Software per l&#39;analisi dei dati </td><td> WaveMetrics </td><td> Igor </td><td></td></tr><tr><td> Specchio per il modulo adattatore </td><td> Rapp optoelettronici </td><td> M70/100 </td><td></td></tr><tr><td> Elettrodo titolare </td><td> Axon Instruments </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Gabbia di Faraday </td><td> Una soluzione su misura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cubo filtro </td><td> Olimpo </td><td> U-ULU </td><td> Filtro di eccitazione rimosso </td></tr><tr><td> Flash lampada </td><td> Rapp optoelettronici </td><td> JML-C2 </td><td></td></tr><tr><td> Pinza Dumont # 55 </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 14099 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro capillari </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> PG10165-4 </td><td></td></tr><tr><td> Con fondo di vetro piatto </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> FD35-100 </td><td></td></tr><tr><td> Illuminatore </td><td> Olimpo </td><td> Evidenziare 3100 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio invertito </td><td> Olimpo </td><td> IX70 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipolatori </td><td> Luigs &amp; Neumann </td><td> SM Mi </td><td></td></tr><tr><td> Micropipetta Puller </td><td> Narishige </td><td> PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> Controllare </td><td> HesaVision </td><td> MTB-01 </td><td></td></tr><tr><td> I filtri a densità neutra </td><td> Omega Optical </td><td> varia </td><td></td></tr><tr><td> Obiettivo 100X </td><td> Zeiss </td><td> Fluar 440285 </td><td> Sia Zeiss o Olympus </td></tr><tr><td> Obiettivo 100X </td><td> Olimpo </td><td> UPLFLN 100XOI2 </td><td> Sia Zeiss o Olympus </td></tr><tr><td> Ottica UV shortpass filtro </td><td> Rapp optoelettronici </td><td> SP400 </td><td></td></tr><tr><td> Patch-clamp amplificatore </td><td> Axon Instruments </td><td> Axopatch 200B </td><td></td></tr><tr><td> Photo Diode Assembly </td><td> Rapp optoelettronici </td><td> PDA </td><td></td></tr><tr><td> Quarzo luce guida </td><td> Rapp optoelettronici </td><td> varia </td><td> Usiamo 600 micron di diametro </td></tr><tr><td> In filo d&#39;argento </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> AGT1025 </td><td></td></tr><tr><td> Argento terreno pellet </td><td> Warner strumenti </td><td> 64-1309 </td><td></td></tr><tr><td> Lampada ad arco allo xeno </td><td> Rapp optoelettronici </td><td> XBL-JML </td><td></td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> BCMCM-gabbia cAMP </td><td> Biolog </td><td> B016 </td></tr><tr><td> Sieroalbumina bovina (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A8806 </td></tr><tr><td> CaCl2 soluzione standard di 0,1 M </td><td> Fluka </td><td> 21059 </td></tr><tr><td> Caged Ca: DMNP-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> D6814 </td></tr><tr><td> Cisteina </td><td> Sigma </td><td> C9768 </td></tr><tr><td> Concanavalina Un tipo V (ConA) </td><td> Sigma </td><td> C7275 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> Sigma </td><td> C4036 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> DNAsi I </td><td> Sigma </td><td> D4527 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> Sigma </td><td> P1767 </td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> Sigma </td><td> L0649 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> Fluka </td><td> 63020 </td></tr><tr><td> Papaina </td><td> Sigma </td><td> P3125 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P1274 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9888 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> Sigma </td><td> P2256 </td></tr></tbody></table>

fotolisi lampo di composti caged nel cilia di neuroni sensoriali olfattivi

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Fotolisi di composti in gabbia permette la produzione di un rapido aumento e localizzato della concentrazione di vari composti fisiologicamente attive 1. Composti in gabbia sono molecole fatte fisiologicamente inattivo da una gabbia chimico che può essere interrotta da un lampo di luce ultravioletta. Qui mostriamo come ottenere patch-clamp registrazioni combinate con fotolisi di composti in gabbia per lo studio della trasduzione olfattiva in dissociato topo neuroni sensoriali olfattivi. Il processo di trasduzione olfattiva (Figura 1) si svolge nel ciglia di neuroni sensoriali olfattivi, dove odoranti legandosi ai recettori porta all&#39;aumento di cAMP che si apre nucleotidi ciclici (CNG) canali 2. Ingresso di Ca attraverso canali CNG attiva Ca-attivati ​​i canali Cl. Mostriamo come dissociare i neuroni dell&#39;epitelio olfattivo del mouse 3 e come attivare i canali CNG o Ca-attivati ​​i canali Cl da fotolisi di cAMP in gabbia in gabbia Ca 4 o 5 &lt;/ Sup&gt;. Noi usiamo una lampada flash 6,7 per applicare lampeggia ultravioletti alla regione ciliare di uncage cAMP o Ca mentre patch-clamp registrazioni sono prese per misurare la corrente in tutta la cellula-voltage-clamp configurazione 8-11.

Fotolisi di composti in gabbia permette la produzione di un rapido aumento e localizzato della concentrazione di vari composti fisiologicamente attivi. Qui mostriamo come ottenere patch-clamp registrazioni combinate con fotolisi di cAMP in gabbia o in gabbia Ca per lo studio della trasduzione olfattiva in dissociato topo neuroni sensoriali olfattivi.

Fotolisi lampo di composti Caged nel Cilia di neuroni sensoriali olfattivi

La fotolisi di composti in gabbia (caged compounds) permette di produrre incrementi rapidi e localizzati nella concentrazione di vari composti fisiologicamente attivi1. ...

Il nostro senso dell'olfatto ci permette di rilevare e riconoscere sostanze chimiche volatili nell'ambiente esterno. Le molecole odorose si legano ai recettori situati nel rivestimento dei neuroni sensoriali olfattivi e attivano una cascata di trasduzione che porta all'apertura di canali attivati da nucleotidi ciclici, seguita dall'apertura di canali al cloruro attivati dal calcio. L'obiettivo generale di questa procedura è mostrare come attivare direttamente questi canali mediante un lampo di luce per liberare composti incapsulati ("cage compounds"), che sono molecole rese fisiologicamente inattive da una "gabbia" chimica.Un fascio di luce ultravioletta rompe una gabbia e libera il composto fisiologicamente attivo incapsulato. Cicl, mp o calcio incapsulato sono inclusi nella soluzione intracellulare, che riempie la pipetta del patch e diffonde nel compartimento delle neuronali sensoriali olfattive. Un lampo ultravioletto viene applicato alla regione Cary per attivare cicl, mp o calcio, mentre vengono effettuate registrazioni in modalità patch clamp per misurare la corrente nella configurazione di voltage clamp su cellula intera.Ciao. Oggi vi mostreremo un procedimento per registra

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