Fotolisi lampo di composti Caged nel Cilia di neuroni sensoriali olfattivi
29 ottobre 2011
Fotolisi di composti in gabbia permette la produzione di un rapido aumento e localizzato della concentrazione di vari composti fisiologicamente attivi. Qui mostriamo come ottenere patch-clamp registrazioni combinate con fotolisi di cAMP in gabbia o in gabbia Ca per lo studio della trasduzione olfattiva in dissociato topo neuroni sensoriali olfattivi.
Il nostro senso dell'olfatto ci permette di rilevare e riconoscere sostanze chimiche volatili nell'ambiente esterno. Le molecole odorose si legano ai recettori situati nel rivestimento dei neuroni sensoriali olfattivi e attivano una cascata di trasduzione che porta all'apertura di canali attivati da nucleotidi ciclici, seguita dall'apertura di canali al cloruro attivati dal calcio. L'obiettivo generale di questa procedura è mostrare come attivare direttamente questi canali mediante un lampo di luce per liberare composti incapsulati ("cage compounds"), che sono molecole rese fisiologicamente inattive da una "gabbia" chimica.
Un fascio di luce ultravioletta rompe una gabbia e libera il composto fisiologicamente attivo incapsulato. Cicl, mp o calcio incapsulato sono inclusi nella soluzione intracellulare, che riempie la pipetta del patch e diffonde nel compartimento delle neuronali sensoriali olfattive. Un lampo ultravioletto viene applicato alla regione Cary per attivare cicl, mp o calcio, mentre vengono effettuate registrazioni in modalità patch clamp per misurare la corrente nella configurazione di voltage clamp su cellula intera.
Ciao. Oggi vi mostreremo un procedimento per registrazioni con tecnica del patch clamp abbinato a stimolazioni fotoelettriche di composti fotoattivabili. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare i canali attivati dal CMP e i canali al calcio attivati dalla colina nei neuroni sensoriali olfattivi. Cominciamo dunque.
Il sistema di registrazione con patch clamp utilizzato in questo caso comprende un microscopio invertito, un sistema di perfusione, un micromanipolatore, un elettrodo di registrazione e un elettrodo di riferimento collegato allo stadio principale dell'amplificatore per patch clamp, il tutto montato su un tavolo antivibrazioni all'interno di una gabbia di Faraday. L'amplificatore per patch clamp è collegato a un convertitore analogico-digitale nel computer, dotato di software per l'acquisizione dei dati. Per generare un lampo di luce ultravioletta ad alta intensità, utilizziamo una lampada flash Excelon.
L'impulso luminoso può essere attivato manualmente o tramite computer utilizzando lo stesso software che controlla l'acquisizione elettrofisiologica. Le lunghezze d'onda migliori per gli esperimenti fotochimici vengono selezionate inserendo un filtro UV in uno slot di uscita o nel lampo della lampada. L'intensità dell'impulso luminoso può essere modificata variando la tensione o la capacità della lampada al flash.
Un controllo più preciso dell'intensità della luce si ottiene posizionando filtri neutri di densità in un secondo slot di uscita della lampada ad arco. L'impulso luminoso viene indirizzato al neurone piastrato su piatti con fondo in vetro attraverso una guida luminosa in fibra ottica di quarzo. La guida luminosa è collegata all'attacco per fluorescenza in episcopia del microscopio invertito.
Utilizzando un adattatore, un cubetto filtro modificato senza filtro di eccitazione indirizza un fascio UV al neurone mediante uno specchio dicròico. La luce viene focalizzata attraverso un obiettivo ad immersione in olio da 100x. L'area coperta dal tessuto viene visualizzata inserendo la guida luminosa in un illuminatore.
L'immagine viene visualizzata su un monitor attraverso una telecamera CCD collegata al microscopio. Sul monitor viene tracciato il controllo dell'area per localizzare la zona da esporre alla luce UV prima della dissezione; preparare tre piatti con fondo in vetro rivestiti con conna a e poli. Per prepararsi alla dissezione, riempire due piatti di Petri da 50 millimetri rivestiti con zucchero con soluzione di Ringer.
Posizionarli sul ghiaccio. Raffreddare anche. Una papa insiste nel mescolare 0,5 millilitri della soluzione arresto e la siringa contenente circa 10 millilitri di soluzione di Ringer.
Iniziare con il topo sacrificato. Rimuovere la pelle che riveste il cranio, tagliare lungo le linee della mascella e posizionare la testa in una piastra di Petri rivestita d'argento. Posizionare la piastra sotto un microscopio stereoscopico utilizzando un bisturi in senso sagittale.
Dissezionare la testa lungo la linea mediana. Ruotare metà della testa con il lato mediale rivolto verso l'alto. Rimuovere con attenzione il setto per esporre i terminali.
Qui mostriamo un'immagine ingrandita mentre si rimuove il setto utilizzando pinzette numero tre nel bisturi. Rimuovere con attenzione le terminazioni rivestite dal vostro epitelio adiposo. Trasferire in un'altra piastra di Petri rivestita d'argento utilizzando pinzette super fini numero 55 e il bisturi.
Separare i frammenti dell'epitelio rifatto dal tessuto sottostante. Trasferire i frammenti di epitelio olfattivo in una provetta contenente un millilitro di soluzione Ringer priva di ioni bivalenti. Quindi aggiungere la papa insteina.
L'utilizzo di forbici microchirurgiche implica che l'incubazione dell'epitelio avvenga a temperatura ambiente per tre minuti; quindi, si procede nuovamente in modo delicato con le forbici microchirurgiche. Attendere altri cinque minuti, quindi utilizzare una pipetta Pasteur con estremità levigata alla fiamma e orifizio largo per trasferire il campione in un tubo contenente la soluzione di arresto. Centrifugare per cinque minuti e scartare il soprannatante. Aggiungere circa un millilitro di soluzione fisiologica filtrata, mescolando delicatamente con una pipetta Pasteur con estremità levigata alla fiamma e orifizio di circa un millimetro di diametro.
Posizionare la soluzione contenente le cellule al centro di tre piatti di vetro. Lasciare che le cellule si depositino in fondo per circa un'ora a quattro gradi Celsius. Quindi aggiungere la soluzione di Ringer.
Lavorare con luce fioca per evitare la degradazione dei composti fotoattivabili dovuta alla luce ambientale. Applicare una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo da 100x. Posizionare una piastra con fondo in vetro contenente i neuroni sensoriali orali dissociati sul portacampioni del microscopio invertito perfu.
Con soluzione di Ringer. Proteggere la siringa contenente la soluzione intracellulare con composti cage dalla luce avvolgendola con carta d'alluminio e mantenerla refrigerata. Cercare un neurone sensoriale olfattivo isolato con ciglia integre.
Spostare la piastra del microscopio in modo da posizionare la regione Cary all'interno dell'area disegnata sul monitor. Per localizzare l'area di flash UV, riempire una pipetta per patch con soluzione intracellulare contenente il composto caging. Inserire la pipetta nel supporto della testata dell'amplificatore Apache Clamp.
Utilizzando tecniche standard di patch clamp. Avvicinarsi al soma del neurone con una pipetta per il patch e ottenere un sigillo giga. Quindi passare alla modalità cellula intera tramite il computer.
Avviare un protocollo di stimolazione e registrare la risposta. Un tipico protocollo di stimolazione fissa il voltaggio a un valore costante e innesca il rilascio di un flash di luce UV per la lisi del composto incapsulato. Ora vi mostreremo alcune registrazioni rappresentative; qui è mostrata la risposta di un neurone sensoriale isolato del grasso di topo alla lisi del ciclompm incapsulato.
La freccia nella parte superiore indica il momento del rilascio di un lampo UV. La corrente attivata da Cycl MP è stata registrata a meno 60 millivolt in una soluzione ringer extracellulare con bassa concentrazione di calcio. La fase crescente della corrente era rapida ed è stata approssimata mediante una singola funzione esponenziale.
Qui osserviamo una registrazione dello stesso neurone immerso in una soluzione di Ringer normale, che contiene un millimolare di calcio. La fase ascendente della corrente a meno 60 millivolt è diventata molto più bassa e multifasica. Ciò è dovuto all'azione del calcio che entra nei canali attivati dal recettore C di riciclo P, e che attiva una corrente secondaria al cloruro.
In questo esempio, abbiamo bloccato il voltaggio a più 60 millivolt. Questo è un altro modo per ridurre l'afflusso di calcio. La fase ascendente della risposta dovuta al caging di cyclone PN a più 60 millivolt è stata ben descritta da un'esponenziale singola, indicando la presenza di un solo componente della corrente.
Un esempio delle risposte ottenute mediante il rilascio fotoindotto di calcio all'interno del cilio è mostrato; questa corrente è trasportata da ioni cloruro. La tensione era di meno 50 millivolt. Risposte di ampiezza crescente sono state indotte dal rilascio fotoindotto di calcio incapsulato mediante lampi UV di intensità crescente.
Abbiamo appena mostrato come effettuare la registrazione da neuroni sensoriali dissociati quando si esegue questa procedura. È importante ricordare di essere molto pazienti. Grazie per aver guardato e buona fortuna con l'esperimento.
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Panoramica
Questo studio illustra l'uso della fotolisi di composti incapsulati per indagare la trasduzione olfattiva nei neuroni sensoriali olfattivi del topo. Mediante registrazioni con tecnica del patch-clamp, i ricercatori possono osservare gli effetti del cAMP incapsulato e del Ca incapsulato sull'attività neuronale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Trasduzione olfattiva
Sfondo
- Il senso dell'olfatto è fondamentale per rilevare sostanze chimiche volatili.
- I neuroni sensoriali olfattivi svolgono un ruolo chiave nella trasduzione dei segnali olfattivi.
- I composti incapsulati sono utilizzati per controllare i tempi di rilascio delle molecole attive.
- La fotolisi consente l'attivazione rapida delle vie di segnalazione.
Scopo dello studio
- Dimostrare l'attivazione dei canali attivati da nucleotidi ciclici.
- Misurare gli effetti del cAMP incapsulato e del Ca incapsulato sui neuroni sensoriali olfattivi.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi di trasduzione del segnale olfattivo.
Metodi Utilizzati
- Registrazioni con tecnica del patch-clamp da neuroni sensoriali olfattivi murini dissociati.
- Utilizzo di cAMP incapsulato e Ca incapsulato nella soluzione intracellulare.
- Applicazione di luce ultravioletta per fotolizzare i composti incapsulati.
- Configurazione del clampaggio in volt in modalità cella intera per la misurazione della corrente.
Risultati principali
- È stata osservata un'attivazione efficace dei canali attivati da nucleotidi ciclici.
- Sono stati ottenuti aumenti localizzati delle concentrazioni di cAMP e di Ca.
- Le registrazioni con tecnica del patch-clamp hanno fornito informazioni sulle risposte neuronali.
- La metodologia ha dimostrato un controllo efficace sulle vie di segnalazione.
Conclusioni
- La fotolisi di composti incapsulati è uno strumento potente per lo studio della segnalazione neuronale.
- Questo approccio può migliorare la nostra comprensione della trasduzione olfattiva.
- Studi futuri possono basarsi su questi metodi per esplorare altre vie di segnalazione.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La fotolisi di composti incapsulati consente un controllo preciso nel tempo e nello spazio di molecole segnale intracellulari, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione precoce di bersagli nel campo delle neuroscienze. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva permettendo l'analisi diretta della funzione dei canali del cloruro attivati dal calcio e dei canali attivati dai nucleotidi ciclici nei neuroni sensoriali olfattivi. Il metodo fornisce una piattaforma traslabile per valutare la dinamica dei canali ionici attivati da ligandi in sistemi neuronali rilevanti per le malattie.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'attivazione diretta dei canali attivati da nucleotidi ciclici per indagare i meccanismi di trasduzione olfattiva e validare ipotesi relative alla segnalazione dipendente dal cAMP.
- Valore operativo: Fornisce aumenti localizzati e rapidi della concentrazione di cAMP o calcio per isolare il contributo di percorsi specifici senza effetti secondari interferenti.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio sui bersagli confermando l'accoppiamento funzionale tra l'attivazione del recettore, la produzione del messaggero secondario e le risposte dei canali ionici a valle.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Combina l'uncaging fotolitico con l'elettrofisiologia in patch-clamp per generare misurazioni quantitative e in tempo reale delle correnti come letture funzionali.
- Riproducibilità: Utilizza parametri standardizzati della lampada a lampo e selezione di filtri UV per garantire un controllo costante dell'intensità luminosa e della lunghezza d'onda tra diversi esperimenti.
- Scalabilità: Impiega guide ottiche in fibra di quarzo e sistemi microscopici invertiti per fornire una stimolazione UV precisa a neuroni dissociati in formati compatibili con piastre a più pozzetti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la patologia: Modella il malfunzionamento dei neuroni sensoriali olfattivi in cui l'attività dei canali attivati da nucleotidi ciclici o dai canali del cloruro attivati dal calcio è alterata, sostenendo studi meccanicistici su condizioni correlate all'anosmia.
- Continuità traslazionale: Collega l'interazione con il bersaglio molecolare (rilascio di cAMP/Ca²⁺) ai fenotipi elettrofisiologici, permettendo la correlazione tra eventi biochimici e l'output neuronale funzionale.
- De-risking meccanicistico: Isola variabili come la concentrazione extracellulare di calcio per distinguere le correnti primarie mediate dai canali attivati da nucleotidi ciclici dai contributi secondari dei canali del cloruro attivati dal calcio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta, consentendo la validazione guidata da ipotesi di bersagli canali ionici prima dell'identificazione del capostazione, con risultati che informano sulla prontezza del saggio per campagne di screening di composti.
- Biologia della scoperta: Consente l'analisi meccanicistica delle vie di trasduzione olfattiva permettendo un controllo temporale preciso del rilascio di messaggeri secondari per valutare la cinetica e la selettività dell'apertura dei canali.
- Screening: Genera letture elettrofisiologiche (ampiezza della corrente, tempo di salita, dipendenza dalla tensione) utilizzabili per valutare gli effetti di composti sulla funzione dei canali attivati da nucleotidi ciclici o dai canali del cloruro attivati dal calcio.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative delle correnti in condizioni di voltage clamp in whole-cell, consentendo il confronto delle risposte evocate fotochimicamente tra diverse condizioni e genotipi.
- Ricerca traslazionale: Collega la dinamica dei messaggeri secondari all'eccitabilità neuronale in un modello di neurone sensoriale rilevante per le malattie, supportando una validazione funzionale allineata ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile di fotolisi ed elettrofisiologia applicabile ad altri composti fotoattivabili e sottotipi neuronali oltre ai sistemi olfattivi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella segnalazione olfattiva consentendo l'attivazione diretta, controllata dalla luce, dei canali attivati da nucleotidi ciclici e dei canali del cloruro attivati dal calcio.
- Valore operativo: Permette un'uncaging riproducibile e localizzata mediante lampo luminoso e sistemi di guida ottica, riducendo al minimo la variabilità nella somministrazione del composto e migliorando la coerenza dei dati.
- Valore strategico: Aumenta la sicurezza nelle decisioni di avanzamento o abbandono della validazione del bersaglio fornendo evidenze causali che collegano le fluttuazioni dei messaggeri secondari agli esiti elettrofisiologici.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione dei bersagli aggiustata in base al rischio, basata sulla funzione confermata dei canali e sulla fedeltà della segnalazione in preparazioni neuronali fisiologicamente rilevanti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in elettrofisiologia con tecnica del patch-clamp, tecniche di fotolisi e dissociazione di neuroni olfattivi.
- È dipendente da una lampada a lampo ultravioletta, una guida luminosa in fibra di quarzo e un microscopio invertito con attacco epifluorescenza per un’erogazione precisa degli UV.
- Necessita della standardizzazione delle concentrazioni intracellulari di composti incapsulati e della composizione della soluzione extracellulare per controllare gli effetti secondari dipendenti dal calcio.
- Comporta considerazioni di adattamento nell’applicazione a diversi tipi neuronali o compartimenti subcellulari, a causa delle variazioni nella diffusione dei composti incapsulati e nella penetrazione della luce UV.
- È limitata dalla necessità di attrezzature specializzate (lampada a lampo, filtri neutri, filtri UV) e da un’attenta manipolazione per prevenire il degrado dei composti incapsulati dovuto alla luce ambientale.
