Autologo di cellule progenitrici endoteliali-Seeding Tecnologie e test di biocompatibilità per dispositivi cardiovascolari in un modello animale di grandi dimensioni

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di seminare impianti vascolari con cellule progenitrici endoteliali autologhe derivate dal sangue, quindi osservare l'effetto di questo trattamento sulla trombosi in un modello animale di grandi dimensioni. Ciò si ottiene ottenendo un campione di sangue periferico da suini per isolare le cellule progenitrici endoteliali suine a crescita tardiva. Successivamente, un dispositivo impiantabile.

Il tubo in titanio nel nostro studio di prova di principio è alloggiato con i PC autologhi. Il dispositivo viene quindi impiantato nella vena cava inferiore del maiale. I risultati mostrano che esiste una protezione contro la trombosi basata sulla pervietà del tubo in titanio con sede in EPC rispetto al tubo di controllo e al tubo metallico nudo occluso.

La Duke Surgery si impegna a promuovere una ricerca innovativa e all'avanguardia. La seguente presentazione è un esempio di come lavoriamo in tutti i dipartimenti e le discipline per far progredire la medicina. Il Dr.EK ha condotto uno sforzo di ricerca per sviluppare una tecnologia di posizionamento cellulare che prevenga la trombosi rivestendo la superficie di contatto con il sangue dei dispositivi vascolari con le cellule progenitrici del paziente.

Poiché queste cellule sono state derivate dagli stessi pazienti che riceveranno l'impianto, evitiamo il rigetto da parte del sistema immunitario. Il nostro successo e i metodi qui descritti sono il risultato di un grande lavoro di squadra. L'impianto chirurgico sarà dimostrato da Sean Gage della sezione di chirurgia vascolare, da Whitney Lane, una studentessa di medicina della Duke, e da me.

Vorrei ora presentare Alexander Janssen, uno studente di dottorato del Dipartimento di Ingegneria Biomedica, che ci guiderà attraverso il processo di semina cellulare In dettaglio, dimostrerò come seminare tubi di titanio con cellule progenitrici endoteliali derivate dal sangue appena prima dell'impianto in un modello di maiale. Questo metodo funge da prova di concetto e gli stessi principi di base possono essere applicati a molti altri dispositivi impiantabili come gli stent in nitinol e i dispositivi meccanici di assistenza circolatoria. Le EPC vengono isolate mediante placcatura della frazione cellulare mononucleata del sangue suino e di solito compaiono dopo circa sette giorni.

Si riconoscono per la loro tipica morfologia a ciottoli. Espandi le EPC a un numero totale di 9 milioni di cellule in coltura. Sciacquare due volte gli EPC preparati in terreno privo di siero, avendo cura di limitarne l'esposizione alla luce durante e dopo l'etichettatura.

Quindi coprire le cellule con un'etichetta fluorescente, PKH 26 e registrare la quantità di soluzione applicata. Incubare le cellule a temperatura ambiente per quattro minuti. Arrestare la reazione di marcatura aggiungendo un volume uguale di siero suino alla soluzione colorante un minuto dopo.

Diluire le soluzioni combinate uno a uno con il terreno di crescita completo. Quindi aspirare il liquido e sciacquare le cellule tre volte con un terreno di coltura completo, seguito da due lavaggi e DPBS senza cloruro di calcio o magnesio. Successivamente, coprire le cellule in tripsina prendendo nota del volume utilizzato e incubarle a 37 gradi Celsius.

Dopo tre minuti di incubazione, utilizzare la microscopia per verificare che le cellule si siano staccate e, in tal caso, aggiungere il doppio della soluzione di neutralizzazione della tripsina rispetto a quella aggiunta. tripsina, combinare le soluzioni cellulari in un'unica provetta e misurare la densità cellulare con un emocitometro. Infine, pellettare la sospensione cellulare e risospendere le cellule in almeno 4,5 millilitri di terreno privo di siero.

Dopo aver preparato il maiale per l'intervento chirurgico, incidere la linea mediana con una lama di bisturi numero 15 dalla seconda serie di ghiandole della memoria. Cran ha portato al penultimo set usando l'elettrocauterizzazione. Portare la dissezione fino alla fascia addominale.

Sollevare il peritoneo con una pinza antizanzare ed entrarvi con cautela con le forbici, esternalizzare la vescica urinaria e posizionare una sutura a tre punti di sutura Vicryl nella parete della vescica. Praticare un'incisione con pugnalata al centro e inserire un catetere di Foley francese 16 nell'incisione. Quindi somministrare liquidi per via endovenosa per titolare la produzione di urina ad almeno un millilitro per chilogrammo all'ora durante l'intervento chirurgico.

Successivamente, esternalizzare l'intestino tenue ingrossato e posizionare due divaricatori chirurgici per esporre l'aspetto posteriore della cavità peritoneale e identificare l'IVC utilizzando una dissezione acuta e smussata. Liberare con cura l'IVC dal tessuto circostante. Quindi scheletrizzare il vaso dall'arteria renale destra prossimale alla biforcazione dell'esercizio distale IVC.

Estrema cura durante la dissezione IVC poiché anche un difetto molto piccolo nell'IVC può portare a una rapida emorragia e dissanguamento dell'animale. Tutti i rami laterali del segmento IVC prestano particolare attenzione sezionando e legando le due grandi vene lombari posteriori immediatamente prossimali alla biforcazione dell'IVC. C'è spesso una grande vena lombare sul lato posteriore.

Sezionare questa vena senza e controllarla con gli anelli dei vasi. Ora, parallelamente all'intervento chirurgico, iniziare a seminare l'impianto con EPC prima di iniziare questa procedura. Gli scaffold in titanio devono essere completamente assemblati e pronti per l'uso in un campo sterile.

Aprire il tubo in titanio sterilizzato a gas in una siringa da cinque cc. Quindi rimuovere lo stantuffo dalla siringa da cinque cc, ma non gettarlo con un cappuccio fisso alla siringa. Utilizzare una pipetta per riempire la siringa con la sospensione EPC.

Quindi sostituire lo stantuffo. Rimuovere il tappo e inserire l'estremità dell'esca della siringa nel tubo di silicone aperto del gruppo fino a quando non è aderente. Ma non rimuovere ulteriormente le bolle facendo avanzare lentamente la soluzione cellulare fino a raggiungere la parte superiore del copricapo.

Quindi chiudere il gruppo con un tappo per esche e fissarlo con del nastro adesivo in un guanto sterile. Inserire l'intero gruppo in un supporto per siringa lavorato a macchina e posizionarlo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Utilizzare un manometro per assicurarsi che le camere di alloggiamento siano livellate e consentire all'assemblaggio di incubare con una rotazione delicata.

Continuare l'intervento chirurgico subito dopo aver legato l'IVC somministrando 100 unità di eparina per chilogrammo di maiale. Quindi bloccare immediatamente l'IVC con un angolo di 45 gradi distalmente sull'IVC e sulla vena lombare, quindi prossimalmente. Quindi, usa una lama di bisturi numero 11 e delle forbici per pentole per eseguire un'otomia venosa longitudinale di quattro centimetri tra i morsetti prossimale e distale.

Evacuare il sangue dall'IVC e lavare il suo lume interno con DPBS sterile. Ora inserire l'impianto con sede EPC o un controllo in metallo nudo nell'IVC per evitare che le cellule si secchino ed evacuare l'aria. Riempire l'IVC con DPBS con cloruro di calcio e cloruro di magnesio.

Quindi chiudere l'otomia venosa con una sutura da corsa a quattro proline e rimuovere un morsetto prossimale per dearilare l'IVC attraverso una piccola quantità di sanguinamento posteriore. Dopo l'emorragia, rimuovere il morsetto distale per mantenere l'impianto in posizione. Applicare una sutura a stralcio nel tubo in PVC che passa attraverso la parete della vena.

Chiudere la fascia con OPDS su un ago CT. Chiudere lo spazio sottocutaneo con due o Vicryl in esecuzione. Quindi pinzare la pelle chiusa.

Somministrare fino a 20 millilitri di marcaina allo 0,25% per via sottocutanea lungo il sito dell'incisione e coprire la ferita con garza e tegaderm per il dolore. Somministrare l'influenza Nixon e l'ossimorfone per via sottocutanea secondo necessità. Interrompere l'anestesia e quando il maiale si sveglia, rimetterlo nella sua gabbia nei successivi sette giorni.

Somministrare atri ogni 24 ore come profilassi antibiotica e assicurarsi che il cerotto di fentanil applicato prima dell'intervento chirurgico rimanga aderente per un totale di tre giorni. Dopo tre giorni, le protesi del tubo di titanio posizionate sono state rimosse e le superfici interne sono state esaminate. Sotto la lunghezza d'onda di eccitazione di 550 nanometri, uno strato confluente di cellule marcate in fluorescenza è stato trovato in un altro tubo.

Le cellule della sezione sono state inoltre colorate con un marcatore di adesione delle cellule endoteliali piastriniche per visualizzare i bordi cellulari. In questa procedura è possibile utilizzare un'ampia varietà di macchie. Al contrario, un impianto di tubo di titanio nudo occlude completamente nell'ambiente protrombotico a bassa quota della vena cava inferiore.

Come illustrato nelle immagini A e C, il tubo di titanio posizionato nella cella è mostrato nell'immagine B ed è rimasto privo di coaguli Seguendo la nostra procedura di isolamento con picco di sangue. L'EPC compare dopo una media di sette giorni in coltura Durante l'esecuzione della procedura chirurgica, è molto importante scheletrare con cura e delicatezza l'IVC perché anche la più piccola lacerazione nell'IVC o nei suoi rami laterali può portare al dissanguamento del maiale. A seguito di questa procedura, altri materiali a contatto con il sangue possono essere rapidamente bugie endoteliali per prevenire la trombosi.

Gli stent vascolari endoteliali, ad esempio, con le nostre EPC imitano il rivestimento nativo della parete dei vasi sanguigni e possono prevenire la ristenosi e la trombosi dello stent dopo il suo sviluppo. La nostra tecnologia Quick See consentirà di rivestire i dispositivi intravascolari con cellule progenitrici endoteliali derivate dal sangue dei pazienti in pochi minuti in sala operatoria o in laboratorio di cateterismo. Pertanto, coltura exvivo prolungata.

Si evita il tempo trascorso sul dispositivo stesso e la tecnologia diventa pratica per la traduzione nella pratica clinica.