Visualizzazione del trasporto intracellulare di merci in astrociti in coltura

Iniziare con una coltura aderente di astrociti primari di topo su un vetrino coprioggetti all'interno di un piatto di coltura.

Incubare con una sonda acidotropica fluorescente che attraversa le membrane cellulari intatte per entrare negli astrociti.

La sonda si accumula selettivamente all'interno di vescicole endolisosomiali acide ed etichetta fluorescentmente le vescicole per monitorarne il trasporto.

Lavare per rimuovere la sonda in eccesso e aggiungere un terreno fresco.

Posizionare la coltura sotto un microscopio confocale e concentrarsi su una singola cellula per eseguire l'imaging time-lapse.

Visualizza il carico etichettato come punti fluorescenti distribuiti all'interno della regione perinucleare

, citosol e processi astrocitici.

Cattura più piani focali lungo l'asse Z per visualizzare il carico in tutto il volume tridimensionale della cella.

Eseguire l'imaging a intervalli definiti per tracciare il trasporto intracellulare del carico a varie profondità all'interno degli astrociti.

Analizza il movimento del carico per distinguere tra carico fermo, carico che si muove verso la periferia della cella e carico che si muove verso il nucleo.

30 minuti prima dell'imaging, diluire un'idonea sonda lisosomiale per marcatura in 200 microlitri di terreno di coltura per astrociti a una concentrazione di lavoro di 1 micromolare e marcare gli astrociti con la sonda per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi lavare le cellule una volta con un terreno di coltura per astrociti caldo e sostituire il lavaggio con un terreno di imaging.

Subito dopo la marcatura della sonda, posizionare il contenitore per la coltura degli astrociti nell'apposito adattatore sul tavolino del microscopio. E usando la luce dell'epifluorescenza, individua le cellule che esprimono proteine fluorescenti o sonda. Utilizzare la fotocamera digitale per regolare l'illuminazione del campione fluorescente per visualizzare le celle selezionate e regolare la messa a fuoco e lo zoom in una singola cella.

Quindi utilizzare le funzioni Zoom e messa a fuoco definita per acquisire una singola serie di time lapse C-stack a una frequenza di un fotogramma ogni due secondi per intervalli di tempo compresi tra 300 e 500 secondi. Salva ed esporta le immagini time lapse come file stack Avi o TIFF.