JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
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Iniziare con una coltura aderente di astrociti primari di topo su un vetrino coprioggetti all'interno di un piatto di coltura.
Incubare con una sonda acidotropica fluorescente che attraversa le membrane cellulari intatte per entrare negli astrociti.
La sonda si accumula selettivamente all'interno di vescicole endolisosomiali acide ed etichetta fluorescentmente le vescicole per monitorarne il trasporto.
Lavare per rimuovere la sonda in eccesso e aggiungere un terreno fresco.
Posizionare la coltura sotto un microscopio confocale e concentrarsi su una singola cellula per eseguire l'imaging time-lapse.
Visualizza il carico etichettato come punti fluorescenti distribuiti all'interno della regione perinucleare
, citosol e processi astrocitici.
Cattura più piani focali lungo l'asse Z per visualizzare il carico in tutto il volume tridimensionale della cella.
Eseguire l'imaging a intervalli definiti per tracciare il trasporto intracellulare del carico a varie profondità all'interno degli astrociti.
Analizza il movimento del carico per distinguere tra carico fermo, carico che si muove verso la periferia della cella e carico che si muove verso il nucleo.
30 minuti prima dell'imaging, diluire un'idonea
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