Generazione sperimentale di carcinoma-Associated fibroblasti (CAF) da fibroblasti umani mammari

Questo video descrive un procedimento per generare fibroblasti associati al carcinoma o calfs a partire da colture primarie di cellule umane. I carcinomi sono tessuti complessi costituiti da cellule neoplastiche e da un compartimento non tumorale denominato stroma. Lo stroma associato al tumore è composto da matrice extracellulare e da una varietà di cellule stromali, tra cui fibroblasti, miofibroblasti, cellule endoteliali, parassiti e leucociti. I fibroblasti associati al carcinoma, ricchi di miofibroblasti, rappresentano un segno distintivo dei fibroblasti attivati presenti all'interno del tumore.

Gli stromeri svolgono un ruolo fondamentale nella promozione della progressione tumorale. Questi possono essere generati in vitro isolando innanzitutto fibroblasti mammarî umani primari da tessuto mammario sano ottenuto mediante mammoplastica riduttiva. Il tessuto ottenuto viene dissociato in una sospensione di singole cellule, quindi immortalato mediante trasduzione virale e modificato geneticamente per esprimere GFP e un gene di resistenza alla puromicina.

Le cellule vengono quindi coiniette insieme a carcinomi mammari umani. Le cellule MCF seven RAs vengono inoculate per via sottocutanea in un topo immunodeficiente. I fibroblasti della memoria umani iniettati si trasformeranno in miofibroblasti del tessuto connettivo tumorali promotori di tumore.

Quindi i fibroblasti mammarî di tipo parentale vengono estratti da xeno-trapianti tumorali e coltivati in presenza di puromicina. Le cellule risultanti, resistenti alla puromicina e chiamate fibroblasti associati al tumore generati sperimentalmente o exp-CAF, mostrano tramite analisi immunoistochimica che i fibroblasti normali umani inizialmente presenti si evolvono in fibroblasti associati al tumore all'interno dello xeno-trapianto, acquisendo la capacità di promuovere la tumorigenesi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'estrazione di CAF primari da pazienti con cancro al seno, è che siamo in grado di generare sperimentalmente CAF da fibroblasti mammarî umani mediante impianto congiunto del tumore.

Il modello generale che illustrerà la procedura sarà Kar, un ricercatore postdottorato nel mio laboratorio, e Ahmed Kar, uno studente di dottorato del laboratorio. Iniziare con un grammo di tessuto mammario umano sano, dissezionato da una mammoplastica riduttiva. Lavare il tessuto più volte in PBS, quindi posizionarlo in una piastra di Petri da 15 centimetri e utilizzare una lametta sterile per tritarlo in piccoli frammenti di dimensioni inferiori a 1,5 millimetri cubi.

Successivamente, utilizzare la lametta per trasferire i frammenti di tessuto in un tubo conico da 15 millilitri contenente 10 millilitri di buffer di dissociazione cellulare per ogni mezzo grammo di tessuto. Quindi vortexare per un minuto alla velocità massima. Posizionare il tubo su un rocker in un incubatore a 37 gradi Celsius e lasciare digerire i frammenti di tessuto per 12-18 ore.

Il giorno successivo, rimarranno ancora molti frammenti di tessuto non digerito nel vortice del tubo. Prima, a velocità massima, posizionare il tubo sul banco e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta fisiologica da cinque millilitri per trasferire il sopranatante arricchito in cellule stromali risultante in un nuovo tubo conico.

Quindi centrifugare la frazione stromale per cinque minuti a 250 ×g. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in PBS, quindi centrifugare nuovamente il campione per cinque minuti a 250 ×g. Successivamente, risospendere il pellet in DMEM integrato con FCS al 10% e trasferirlo in una piastra di Petri da 15 centimetri.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo otto-dieci giorni, le cellule dovrebbero essere confluenti. A questo punto, le cellule vengono raccolte e possono essere congelate per la conservazione a lungo termine.

Per immortalizzare i fibroblasti umani normali primari isolati, introdurre un vettore retrovirale P MIG che esprime sia H turt che GFP; coltivare le cellule per quattro-cinque giorni, quindi selezionare le cellule GFP positive mediante citometria a flusso. Introdurre un costrutto retrovirale P babe puro che codifica per un gene di resistenza alla puromicina nei fibroblasti immortalizzati etichettati con GFP. Coltivare le cellule per cinque-sette giorni in presenza di puromicina ad una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro.

Per isolare i fibroblasti umani della memoria immortalati resistenti alla PUR micina e marcati con GFP. Successivamente, verificare se i fibroblasti producono virus attivi, in grado di determinare il trasferimento orizzontale dei geni che codificano per GFP e la resistenza alla pur micina. Coltivare 2,5 × 10⁵ fibroblasti umani della memoria immortalati resistenti alla pur micina in una piastra di Petri da sei centimetri per due giorni.

Raccogliere e filtrare il mezzo condizionato dei fibroblasti mediante un filtro per siringa con porosità di 0,45 micron. Quindi aggiungere a 10 t e mezzo di cellule di fibroblasti murini e coltivare per 12 ore in presenza di cinque microgrammi per millilitro di protein solfato, che aumenta l'efficienza dell'infezione virale dopo 12 ore. Cambiare il mezzo con DMEM integrato con 10% FCS e coltivare per ulteriori due giorni.

Esaminare le cellule mediante microscopia a fluorescenza. Le cellule T e mezza infettate dal virus GFP risulteranno positive al GFP. A questo punto, sostituire il mezzo per trattare le cellule con un microgrammo per millilitro.

Selezionare con puromicina per cinque a sette giorni. Osservare nuovamente le cellule mediante microscopia a fluorescenza per determinare se si sono formate colonie di cellule tentacolari e mezzo resistenti alla puromicina. Si noti che il trasferimento orizzontale di geni mediato da virus attivi prodotti dai fibroblasti umani mammari parentali resistenti alla puromicina e marcanti con GFP potrebbe rendere resistenti le cellule murine sensibili alla puromicina circostanti e le cellule di carcinoma.

Resistenti alla puromicina e positive per GFP all'interno del xeno innesto tumorale. Questo potrebbe ostacolare il processo di isolamento dei fibroblasti mammarî umani puramente resistenti alla puromicina etichettati con GFP iniettati dallo xeno innesto tumorale, al fine di generare sperimentalmente fibroblasti associati al carcinoma da iniettare in un topo immunodeficiente. Iniziare con la tripsinizzazione e il conteggio della linea cellulare mammaria umana appena preparata insieme alla linea cellulare di carcinoma mammario umano MCF seven RAs in nuovi tubi microcentrifuga.

Sospendere 1 × 10⁶ cellule di carcinoma mammario umano MC77HRA e 3 × 10⁶ fibroblasti mammarî umani immortali resistenti alla puromicina e marcanti con GFP in 400 µL di mezzo di coltura contenente al 50% Matrigel per iniezione. Porre i tubi sul ghiaccio come controllo.

Preparare anche gli stessi fibroblasti della mammella umana senza le cellule MCF seven RAs. Successivamente, utilizzando un ago da 27 gauge, iniettare la miscela cellulare in un sito sottocutaneo di un topo nudo immunodeficiente per esaminare la variazione intratumorale dei fenotipi dei calfs. Isolare i calfs e i fibroblasti di controllo da alcuni diversi xenotrapi tumorali.

Quindi impiantare ciascuna miscela nei lati destro e sinistro di ciascun topo. Lasciare crescere gli xenotrapi di tumore o fibroblasti per 42 giorni dopo l'iniezione. Il periodo di incubazione dei fibroblasti all'interno dell'espianto tumorale deve essere ottimizzato in base al fenotipo di miofibroblasto acquisito dai fibroblasti parentali nel tumore.

Per estrarre i fibroblasti di vitello o di controllo dal topo sacrificato, posizionare in piatti separati almeno 0,5 grammi di tessuto xenotrapiantato e almeno 0,1 grammi di tessuto xenotrapiantato di fibroblasti. Successivamente, utilizzare una lametta sterile per tritare il tessuto in piccoli frammenti di dimensioni inferiori a 1,5 millimetri cubi. Quindi, usare la lametta per trasferire i frammenti di tessuto in un tubo conico da 15 millilitri contenente il buffer di dissociazione cellulare e vortexare per un minuto alla velocità massima. Incubare la sospensione cellulare per tre ore a 37 gradi Celsius con agitazione lenta continua, quindi centrifugare la sospensione cellulare.

Centrifugare per cinque minuti a 250 ×g per dissociare le cellule dal tumore o dall’innesto di vetroresina. Risospendere il pellet cellulare in PBS e ripetere la centrifugazione. Quindi risospendere il pellet cellulare ottenuto in DMEM integrato con il 10% di FCS per isolare la coltura di fibroblasti mammarî umani resistenti alla puromicina.

Le cellule derivate dal tumore o dai fibroblasti vengono coltivate in una piastra di Petri da 15 centimetri in presenza di un microgrammo per millilitro di puramicina, a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Questo eliminerà eventuali cellule carcinoma contaminate e/o murine.

Le cellule stromali propagano le cellule fino alla confluenza e conservano le cellule a meno 80 gradi Celsius utilizzando un mezzo di congelamento. Si noti che le cellule risultanti resistenti alla puromicina, indicate come fibroblasti di vitello XP di 42 giorni o cellule fibroblastiche di controllo uno, sono immortali e positive per GFP. I fibroblasti umani di memoria aumentano il loro fenotipo miofibroblastico promuovitore di tumori all'interno dell'innesto eterotrasplantato interagendo con le cellule carcinomatose durante la progressione tumorale. Mescolare una volta 10 alla sesta cellule MCF sette RAs e tre volte 10 alla sesta fibroblasti di vitello P di 42 giorni.

Una cellula in 400 microlitri di mezzo di coltura con iniezione di 50% di Matrigel in una provetta da 1,5 millilitri. Preparare inoltre tre volte 10 alla 6 cellule di fibroblasti di controllo di 42 giorni senza cellule di carcinoma in una provetta per potenziare ulteriormente i fenotipi mioblastici promotori di tumore delle cellule exp calf una. Iniettare una miscela di queste cellule con cellule CF sette RAs per via sottocutanea in un topo nudo. Iniettare anche le cellule di fibroblasti di controllo da sole, senza cellule tumorali, per preparare le cellule di controllo se necessario.

Incubare le cellule exp calf one per ulteriori periodi di 200 giorni all'interno dell'xenotrapianto tumorale per generare le cellule exp C two e potenziare il fenotipo mioblastico promotorio del tumore. Generare inoltre le cellule controllo fibroblasti two come controllo rispetto alle cellule exp calf two, iniettando cellule fibroblastiche controllo one senza cellule carcinoma in un topo, rimuovendo i tumori e collocandoli in piatti per colture tessutali.

Dissezionare e dissociare il tumore o l'innesto seno-fibroblastico in una sospensione di singole cellule e coltivarle. Colture le cellule in una piastra di Petri da 15 centimetri con F-C-S-D-M-E-M al 10% in presenza di puromicina, propagando le cellule fino al completo distacco mediante tripsina, quindi conservare le cellule a meno 80 gradi Celsius utilizzando un mezzo di congelamento. Le cellule risultanti resistenti alla puromicina vengono denominate cellule 242 giorni exp calf due o cellule controllo fibroblastico due. Le cellule exp calf due etichettate con GFP e le cellule controllo fibroblastico due, estratte da innesti eterotopici di tumore mammario, sono state analizzate mediante immunoistochimica. Come mostrato in questa immagine, le cellule risultano fortemente positive per marcatori mesenchimali, tra cui la prolo 4-idrossilasi specifica per l'uomo, collagene di tipo I, fibronectina, S100A4 e la proteina superficiale dei fibroblasti.

Questi risultati indicano un'origine umana e una natura mesenchimale di queste cellule. Al contrario, la citocheratina, un marcatore delle cellule epiteliali, non è risultata positiva in questi fibroblasti GFP positivi considerati nel complesso. Questi dati suggeriscono che le cellule EXP C due e i fibroblasti di controllo due derivano dai fibroblasti mammarî umani parentali inizialmente introdotti in xenotrapianti murini.

È importante notare che un numero molto maggiore di cellule XP calf due ha mostrato una colorazione positiva per l'alfa SMA e per la glicoproteina matriciale extracellulare to nasin C, entrambi marcatori dei miofibroblasti, rispetto ai fibroblasti di controllo due cellule. Si osserva inoltre che una percentuale maggiore di miofibroblasti positivi per l'alfa SMA è presente nelle cellule XP calf due rispetto a quella osservata nelle cellule XP calf uno di 42 giorni. Questi dati dimostrano che i fibroblasti residenti di memoria umana si differenziano progressivamente in miofibroblasti calf all'interno di xeno-trapianti tumorali durante la progressione tumorale, dopo il loro sviluppo.

Il modello di xenotrapianto tumorale di complementazione ha aperto la strada ai ricercatori che studiano il microambiente tumorale, permettendo di analizzare i processi di evoluzione del fibroblasto normale in cellula tumorale. Quindi, ad esempio, il fibroblasto.