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Inizia con un software per microscopio confocale e imposta i parametri di acquisizione dell'immagine.
Quindi, prendi una sezione del cervello di un topo montata su un vetrino. Questa sezione è colorata con anticorpi che prendono di mira i componenti della barriera emato-encefalica.
La barriera emato-encefalica è un'interfaccia cellulare selettiva tra il flusso sanguigno e il cervello per mantenere l'omeostasi.
Applicare una goccia di olio da immersione con l'indice di rifrazione desiderato sul vetrino coprioggetti per ottimizzare la risoluzione e ridurre al minimo la rifrazione della luce.
Posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio e utilizzare la lampada a epifluorescenza per visualizzare il campione.
Utilizzando i filtri appropriati, individuare i nuclei colorati con DAPI e identificare il segmento capillare per l'imaging.
Avvia la scansione in tempo reale e regola i parametri per ciascun canale fluorescente per acquisire immagini di alta qualità.
Infine, definisci i punti di inizio e fine per l'acquisizione Z-stack per generare un'immagine tridimensionale della barriera emato-encefalica.
Nel menu Acquisizione del software che controlla il microscopio, impostare i parametri di acquisizione dell'immagine. Nel menu a discesa delle dimensioni dell'immagine, seleziona un valore di 1.024 x 1.024 pixel. Modificate la dimensione dei pixel a un valore compreso tra 200 e 300 nanometri regolando il valore del menu Zoom.
Nel menu a discesa Velocità di acquisizione, selezionare un valore di 400 hertz. Successivamente, nel menu Impostazioni di sistema, seleziona la profondità dei pixel e modifica il valore a 12 bit. Quindi, nel software del microscopio, all'interno della scheda Acquisizione, attivare l'opzione per l'acquisizione sequenziale del fotogramma. Impostare lo spessore della sezione ottica su un valore compreso tra 0,75 e 1 micrometro per ciascun canale, modificando il valore nel menu Pinhole.
Aggiungere una goccia di olio da immersione con un indice di rifrazione di 1,52 sulla parte superiore del vetrino coprioggetti, con la sezione del cervello in modo che corrisponda all'indice di rifrazione del vetrino coprioggetti e dell'obiettivo. Successivamente, posizionare il campione nel microscopio e accendere la lampada epifluorescente per visualizzare il campione utilizzando il binocolo del microscopio. Quindi, premere il pulsante per avviare la modalità di scansione dal vivo. Durante la scansione, regolare il guadagno e l'intensità del laser per ciascun canale per massimizzare la gamma dinamica delle immagini ed evitare la saturazione dei pixel. Successivamente, stabilire le sezioni iniziale e finale per l'esecuzione di pile ottiche a Z che coprono l'intero volume del capillare e utilizzare una dimensione del passo di 0,45 micrometri.
È importante sottolineare che tutte le impostazioni di acquisizione devono essere mantenute identiche durante la sessione di imaging.