Imaging del recettore dell'estrogeno α in Rat Arteriole Pial utilizzando un microscopio digitale immunofluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere una tecnica semplice per ottimizzare la colorazione e la visualizzazione del recettore degli estrogeni alfa utilizzando sezioni trasversali di arterie peel ottenute dai cervelli di ratti femmina. Questo viene realizzato rimuovendo innanzitutto le arterie peel colorate con il colorante blu di Evans dalla superficie del cervello e tagliandole in anelli di otto micron mediante un criostato dopo la sezionatura. Le sezioni trasversali vengono montate su vetrini e incubate con l'anticorpo primario contro il recettore degli estrogeni alfa.

Successivamente, i campioni vengono incubati con l'anticorpo secondario e con la controcolorazione utilizzando un mezzo di montaggio contenente dpi. Infine, i segmenti di vasi pellicolati marcati con fluorescenza vengono acquisiti e convertiti in immagini 2D mediante software per la messa a fuoco con profondità estesa. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano il recettore per gli estrogeni alfa nei capillari pellicolati attraverso l'uso di un microscopio a fluorescenza Nikon dotato di software per la profondità estesa.

Il mio nome è dottoressa Marguerite Littleton Kearney. Oggi, il dottor Neil Far ani, ricercatore postdottorato nel mio laboratorio, illustrerà una procedura semplice per ottimizzare la visualizzazione e la colorazione del recettore degli estrogeni alfa in peel.

Arterie cerebrali di un ratto che sono state perfuse con colorante blu di Evans e conservate a meno 70 gradi Celsius. Utilizzando un microscopio stereoscopico, identificare le arterie superficiali del cervello e rimuoverle con pinzette a punta fine. Rimuovere con attenzione qualsiasi tessuto cerebrale aderente.

Posizionare le arterie in un piccolo tubo da prova su ghiaccio. Fissare le arterie in formaldeide fredda al 2% in 0,1 mole di PBS per 30 minuti. Per preparare le arterie per la sezionatura, versare il mezzo di inclusione su un disco refrigerato impostato a meno 20 gradi Celsius.

Posizionare un tratto di arteria in piano sul chug e attendere che si congeli. Una volta congelato saldamente, posizionare l'arteria in posizione verticale nel mezzo di inclusione sul disco di congelamento del criostato. Assicurarsi che l'estremità dell'arteria sia rivolta in avanti.

Tenere l'arteria con pinzette fino a quando non sarà completamente congelata. Posizionare il disco di congelamento con l'arteria sulla testa del criostato e quindi tagliare anelli arteriosi di otto micron direttamente su un vetrino. Montare le sezioni arteriose su gelatina al cromo e potassio.

Spostare le vetturelle utilizzando due pennelli per raddrizzare gli anelli arteriosi. Conservare le vetturelle preparate in una scatola per vetrini in frigorifero a quattro gradi Celsius durante la notte. Rimuovere le vetturelle dal frigorifero e portarle a temperatura ambiente sul bancone del laboratorio.

Lavare i vetrini con uno a 1,5 millilitri di PBS 0,1 molare. Dopo 10 minuti, rimuovere il PBS e ripetere altre due volte. Dopo l'ultimo lavaggio con PBS, incubare i vetrini in un millilitro di cloruro di ammonio 50 millimolare per 30 minuti a temperatura ambiente al fine di ridurre la fluorescenza endogena. Lavare quindi i vetrini con PBS 0,1 molare per 3 volte, 10 minuti per ogni lavaggio, come descritto in precedenza. Successivamente, bloccare i vetrini in una soluzione di PBS contenente 0,1% di Triton X-100 e 1% di siero di capra normale per 30 minuti per ridurre il legame non specifico dell'anticorpo primario.

Dopo il blocco, incubare i vetrini con l'anticorpo primario contro ER alfa diluito alla concentrazione di 1:500 nella soluzione di blocco, durante la notte a quattro gradi Celsius. Rimuovere i vetrini dal refrigeratore e portarli a temperatura ambiente. Lavare via l'anticorpo primario non legato con 1-1,5 millilitri di PBS 0,1% per 3 volte, 10 minuti ciascuna.

Ogni volta, incubare i vetrini con il secondo anticorpo anticoniglio Oregon Green 488 in soluzione di blocco per due ore al buio a temperatura ambiente; dopo l'incubazione, lavare i vetrini in PBS 0,1 M per 3 volte, 10 minuti per ogni lavaggio, quindi portarli in una cappa ventilata. Applicare una goccia di mezzo di montaggio contenente DAPI sui campioni, quindi posizionare un coprioggetto sopra il campione. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente e lasciarlo asciugare completamente.

Inserire le vetrine preparate con i segmenti di vasi della buccia colorati sotto il microscopio e regolare per visualizzare le aree di interesse marcate con fluorescenza. La visualizzazione dell'ER alpha colorato è il passaggio più difficile di questa procedura. Individuare il piano del vaso tagliato con i recettori più nitidi.

Iniziare con un ingrandimento di 100 volte, quindi aumentare l'ingrandimento fino a 600 volte. Utilizzare la fotocamera per acquisire immagini nei canali DPI e ZI rispettivamente per i nuclei cellulari e DR alpha, quindi utilizzare un software per convertire più viste di segmenti vascolari in immagini 2D. Qui vengono mostrati i risultati della colorazione immunofluorescente per ER alpha in verde e la controcolorazione con DPI.

In blu, in un anello di arteria peel isolato dal cervello di un ratto femmina, le immagini sovrapposte suggeriscono la presenza di recettore nucleare per gli estrogeni alfa. Utilizzando una combinazione di immagini Zack, è possibile ottenere un'immagine focalizzata dell'immunofluorescenza del recettore ER alfa, tenendo conto dell'autofluorescenza. Devono essere eseguiti controlli negativi per l'autofluorescenza sia per l'anticorpo primario che per quello secondario. Si noti l'autofluorescenza distinta lungo il lato endoteliale di un'arteria che non è stata incubata con l'anticorpo secondario.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe essere in grado di isolare e rimuovere i vasi arteriosi dalla superficie cerebrale e di preparare anelli trasversali di otto micron. Inoltre, si dovrebbe acquisire familiarità con il recettore fluorescente dell'estrogeno alfa e con la visualizzazione dei recettori mediante un microscopio immunofluorescente digitale e il software Nikon NIS-Elements.