JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:39 min • June 17th, 2025
Prendi un vetrino coprioggetti con neuroni primari geneticamente modificati in una camera di imaging riempita con un tampone di imaging.
Queste cellule esprimono un indicatore redox fluorescente basato su proteine nella matrice mitocondriale.
Posizionare la camera sotto un microscopio a fluorescenza, identificare le cellule sotto la luce visibile, quindi passare all'imaging a fluorescenza.
Applicare due lunghezze d'onda di eccitazione per stimolare l'indicatore e misurare l'emissione di fluorescenza.
Il rapporto di intensità della fluorescenza a queste lunghezze d'onda riflette lo stato di ossidazione mitocondriale.
Introdurre NMDA per attivare i recettori NMDA cellulari, causando afflusso intracellulare di calcio.
L'aumento innesca l'assorbimento mitocondriale del calcio, inducendo la produzione di ROS e l'ossidazione mitocondriale
.
Il ROS ossida l'indicatore, alterandone la fluorescenza e aumentando il rapporto del segnale.
Introdurre agenti ossidanti per ossidare completamente l'indicatore, massimizzando il rapporto del segnale.
Rimuovere il tampone, quindi introdurre agenti riducenti per ridurre completamente il colorante, riducendo al minimo il rapporto del segnale.
Utilizzare i rapporti di segnale massimo e minimo per calibrare e quantificare l'ossidazione mitocondriale indotta da NMDA.
Per l'imaging dal vivo, impostare l'intervallo di time-lapse su 30 secondi e la durata su 25 minuti. Quindi, montare le cellule, posizionare la camera al microscopio e mettere a fuoco le cellule come dimostrato in precedenza. Passa alla modalità di scansione e utilizza il canale a 488 nanometri nella visualizzazione in tempo reale per mettere a fuoco e localizzare le cellule per l'imaging. Facoltativamente, per aumentare il numero di celle registrate per seduta, utilizzare la funzione multipunto per visualizzare da due a tre campi visivi per vetrino coprioggetti.
Avviare l'acquisizione time lapse e registrare cinque immagini come registrazione di base di due minuti. Aggiungere 500 microlitri di soluzione NMDA tre volte alla camera per ottenere la concentrazione finale di 30 micromolari e registrare ulteriori 20 immagini come risposta NMDA di 10 minuti. Quindi, aggiungere 500 microlitri di soluzione quattro volte DA alla camera e registrare altre sei immagini. Aspirare il tampone dalla camera di imaging e sostituirlo con 1 millilitro di soluzione DTT. Dopo aver registrato altre 10 immagini, terminare la registrazione e salvare la serie di immagini.