JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:39 min. • June 17th, 2025
Prendi un vetrino coprioggetti con neuroni primari geneticamente modificati in una camera di imaging riempita con un tampone di imaging.
Queste cellule esprimono un indicatore redox fluorescente basato su proteine nella matrice mitocondriale.
Posizionare la camera sotto un microscopio a fluorescenza, identificare le cellule sotto la luce visibile, quindi passare all'imaging a fluorescenza.
Applicare due lunghezze d'onda di eccitazione per stimolare l'indicatore e misurare l'emissione di fluorescenza.
Il rapporto di intensità della fluorescenza a queste lunghezze d'onda riflette lo stato di ossidazione mitocondriale.
Introdurre NMDA per attivare i recettori NMDA cellulari, causando afflusso intracellulare di calcio.
L'aumento innesca l'assorbimento mitocondriale del calcio, inducendo la produzione di ROS e l'ossidazione mitocondriale
.
Il ROS ossida l'indicatore, alterandone la fluorescenza e aumentando il rapporto del segnale.
Introdurre agenti ossidanti per ossidare completamente l'indicatore, massimizzando il rapporto del segnale.
Rimuovere il tampone, quindi introdurre agenti riducenti per ridurre completamente il colorante, riducendo al minimo il rapporto del segnale.
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