JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:57 min. • June 18th, 2025
Inizia con un piccolo RNA interferente che sopprime l'espressione della proteina prionica, una proteina legata alle malattie neurodegenerative da prioni.
Aggiungere una sospensione di liposomi cationici.
Il siRNA caricato negativamente si lega alla superficie del liposoma caricato positivamente.
Introdurre il peptide RVG-9r, una glicoproteina del virus della rabbia attaccata a una coda di poliarginina.
I residui di arginina facilitano il legame con RVG-9r-siRNA.
Iniettare i complessi liposoma-siRNA-peptide nella vena della coda di un topo anestetizzato.
Gli LSPC circolano attraverso il flusso sanguigno e raggiungono il cervello.
Il peptide RVG-9r si lega ai recettori nicotinici dell'acetilcolina sulle cellule endoteliali, innescando la transcitosi mediata dal recettore attraverso la barriera emato-encefalica.
All'interno del cervello, RVG-9r si lega ai recettori neuronali dell'acetilcolina, facilitando l'endocitosi LSPC e il rilascio di siRNA.
Il complesso di silenziamento indotto dall'RNA si lega al siRNA.
Il filamento passeggero si dissocia, mentre il filamento guida si lega e scinde l'mRNA della PrP, impedendo la traduzione e riducendo l'espressione della PrP.
Aggiungere 20 microlitri della sospensione liposomica da 4 nanomoli a 200 microlitri di una soluzione di siRNA stock da 20 micromolari e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 80 microlitri di un stock da 500 micromolari di peptide mirato a RVG-9r alla soluzione liposomica siRNA e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver anestetizzato un topo utilizzando il 2-3% di isofluorano in ossigeno, coprire gli occhi del topo con un unguento oftalmico e confermare l'anestesia eseguendo un pizzicamento delle dita. Procedere solo se una reazione è assente. Mantenendo l'anestesia, posizionare il mouse sulla schiena o su un lato per accedere alla vena caudale.
Pulisci la coda con etanolo al 70%, quindi usa una siringa da insulina calibro 26 per iniettare 300 microlitri di LSPC o PALETS nella vena della coda. Iniziare l'iniezione distalmente e muoversi prossimalmente se la vena collassa o si rompe. Metti il topo in una gabbia pulita fino a quando non mantiene la decubito sternale.