JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:00 min • June 17th, 2025
Prendi una fetta di cervello di topo fissata chimicamente in una piastra multipozzetto.
Il tessuto contiene assoni circondati da guaine mieliniche ricche di lipidi. I corpi cellulari contengono corpi di Nissl composti da reticolo endoplasmatico ruvido e ribosomi.
Incubare in una soluzione di permeabilizzazione contenente un colorante fluorescente di Nissl. La soluzione permeabilizza le membrane cellulari, consentendo alla colorazione di legarsi all'RNA ribosomiale all'interno dei corpi di Nissl e di marcare i corpi cellulari.
Posizionare il tessuto sotto un microscopio confocale con un sistema di imaging coerente anti-spettroscopia Raman anti-Stokes, o CARS.
Pompa sincronizzata diretta e raggi laser Stokes sul tessuto, sintonizzati per eccitare i legami molecolari nella guaina mielinica ricca di lipidi.
Introdurre un raggio laser a sonda per interagire con i legami eccitati e produrre un segnale anti-Stokes specifico per la mielina.
Un fotorivelatore cattura il segnale per generare un'immagine specifica della mielina.
Utilizza l'imaging confocale per catturare i segnali dai corpi Nissl etichettati.
Sovrapponi le immagini confocali e CARS per visualizzare l'architettura neuronale.
Dopo aver preparato i tessuti come descritto nel manoscritto, colorare le sezioni flottanti per Nissl e i terreni anticorpali per visualizzare i corpi cellulari. Quindi, incubare le sezioni su un agitatore da laboratorio standard per 30 minuti a temperatura ambiente. Prima di portare i campioni al microscopio, accendere e riscaldare il laser CARS per almeno un'ora. Quindi, allineare il laser CARS sovrapponendo spazialmente la pompa e i raggi laser Stokes e regolare il ritardo tra i due raggi laser.
Kohler l'ottica del condensatore e il diaframma del microscopio per l'imaging CARS in avanti. Quindi, regolare il periscopio esterno per centrare i due laser spazialmente sovrapposti sugli specchi della testa di scansione del microscopio. Per il miglior rilevamento avanzato CARS non descansionato, assicurarsi che il condensatore sia kohlered.
Per l'imaging confocale in immunofluorescenza e l'imaging CARS, è possibile dotare il laser CARS di rivelatori non descanneti sia in avanti che con epi-CARS incorporando un microscopio confocale dotato di laser visibili per l'imaging a fluorescenza. Ora, posiziona le sezioni in una piastra di coltura con fondo coprioggetti e PBS per evitare di seccare il tessuto. Inoltre, usa un peso di vetro per mantenere il fazzoletto vicino al vetrino coprioggetti.
Utilizzo dell'interfaccia utente grafica. Imposta i parametri di acquisizione delle immagini per l'imaging confocale a fluorescenza CARS e Nissl. Posizionare il campione sul tavolino del microscopio. Mettere a fuoco il campione e acquisire le immagini.