Visualizzazione proteine e complessi macromolecolari di Negative EM Stain: dalla preparazione alla griglia Image Acquisition
December 22nd, 2011
Campioni di proteine di visualizzazione negativo microscopia elettronica macchia (EM) è diventato un metodo popolare di analisi strutturale. È utile per l'analisi quantitativa strutturale, come ad esempio calcolare una ricostruzione 3D delle molecole in fase di studio, e anche per l'esame qualitativo della qualità della preparazione delle proteine. In questo articolo presentiamo protocolli dettagliati per la preparazione delle griglie EM, colorazione del campione e visualizzando il campione in un microscopio elettronico. Gli utenti meno esperti possono seguire questi protocolli in modo semplice e di utilizzare negativo EM macchia come un test di routine, oltre ad altri saggi biochimici, per valutare i loro campioni di proteine.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare campioni di proteine purificate mediante microscopia elettronica a colorazione negativa. Ciò si ottiene preparando prima le griglie di microscopia elettronica che sosterranno il campione. Il secondo passo della procedura consiste nel preparare la soluzione di colorazione negativa.
Successivamente, il campione viene applicato sulla griglia di microscopia elettronica e colorato negativamente. Infine, la griglia EM viene caricata in un microscopio elettronico e le immagini vengono registrate in condizioni ottiche appropriate. Le immagini DEM convenzionali in campo chiaro sono ad alto contrasto e nitidamente dettagliate, mostrando una singola macromolecola sparsa su uno sfondo privo di caratteristiche.
La microscopia elettronica a colorazione negativa è un metodo semplice per visualizzare la tua proteina preferita. Può essere utilizzato come test di routine per esaminare le proteine purificate, sia per analisi strutturali che per altri test biochimici e biofisici. Qui dimostriamo come preparare un campione colorato negativamente per la microscopia elettronica.
La dimostrazione visiva di questo metodo è utile in quanto alcuni passaggi sono difficili da apprendere dalle descrizioni del testo e dalle figure. Inizia usando una pipetta di vetro per mettere una singola goccia di collodio in un grande becher d'acqua sulla superficie dell'acqua. Man mano che il collodio si diffonde, può catturare la polvere dalla superficie dell'acqua.
Rimuovere e sostituire una pellicola polverosa di plastica al collodio con un'altra goccia. Quindi posiziona tra 50 e 100 griglie EM una per una sulla pellicola di plastica galleggiante con il lato lucido rivolto verso il basso. Seleziona 400 griglie mesh per la colorazione negativa di routine e seleziona 200 griglie mesh.
Per la raccolta di immagini di coppie inclinabili. Selezionare un pezzo di carta non stropicciata ad assorbimento lento che sia leggermente più grande dell'area delle griglie. Posizionare la carta sopra le griglie e attendere che la carta si bagni completamente.
La carta non deve assorbire l'acqua troppo rapidamente. Usiamo la carta di un blocco note economico. Le griglie sono ora inserite tra il film plastico e la carta.
Usa un paio di pinze per mettere la carta in una capsula di Petri per asciugarla lentamente all'aria. Evita metodi di asciugatura più rapidi in quanto possono portare alle rughe. La macchina per la verniciatura del carbonio utilizzata nel nostro laboratorio è una coer in carbonio turbo ad alto vuoto Creston 2 0 8 C.
Dotato di un monitor dello spessore del film Creston. Il monitor utilizza una bilancia di quarzo sensibile ai depositi di carbonio. Tuttavia, il protocollo qui descritto non richiede questo dispositivo Iniziare affilando e caricando le barre di carbonio in una macchina per il rivestimento del carbonio.
Mano successiva, un vetrino con grasso sottovuoto che lascia metà dell'area smerigliata non rivestita Dopo il rivestimento in carbonio, le regioni ingrassate del vetrino vengono utilizzate per stimare lo spessore del rivestimento di carbonio. Posizionare la carta con le griglie sul palco sotto la campana di vetro della macchina per il rivestimento del carbonio. Posizionare il vetro unto.
Scorri accanto alle griglie. Pompare la camera a vuoto fino ad almeno 10 micro giri, altrimenti le scintille genereranno molte particelle di grandi dimensioni nella griglia. Ora aumenta la corrente molto lentamente.
La punta affilata dell'asta di carbonio diventerà estremamente luminosa. Non osservarlo ad occhio nudo all'inizio del rivestimento, il vetrino cambierà colore in un grigio scuro man mano che il rivestimento di carbonio si accumula, taglia la corrente allo spessore di carbonio desiderato e tieni conto della trasparenza della campana di vetro. Quando si esprime questo giudizio, una volta che l'oscurità del vetrino è calibrata sullo spessore del carbonio, questo metodo è accurato quanto il più costoso monitor dello spessore del film.
Al termine del processo, sfiatare la camera a vuoto e rimuovere le griglie rivestite per un uso successivo. Il sottile strato di plastica non influirà sulla qualità dell'immagine macchiata negativamente, ma può essere rimosso immergendo le griglie nel cloroformio per diverse ore prima di procedere. Preparare una soluzione fresca di formiato di urina L o utilizzare una soluzione conservata al buio per meno di due settimane.
Una buona soluzione fresca ha un colore giallo, un pH di circa quattro e funziona in modo molto pulito senza precipitati. Inizia utilizzando un sistema disponibile in commercio per illuminare. Scaricare le griglie rivestite in carbonio.
Successivamente, due gocce da 20 microlitri di acqua distillata e 2 gocce da 25 microlitri di soluzione di formiato fresco per orinatoio su un pezzo di perfil. Utilizzando una pinza anticapillare a forza inversa, tenere una griglia scaricata a bagliore, con il lato rivestito in carbonio rivolto verso l'alto. Criticamente, queste pinze non aspirano il liquido dalle griglie.
Ora applica due microlitri di campione di proteine sulla griglia e attendi che le proteine vengano assorbite nella griglia. In genere ci vogliono 30 secondi, ma i campioni molto diluiti richiedono più tempo, il che può influire sulle concentrazioni dei tamponi. Al termine, tamponare il campione di proteine con carta da filtro.
Quindi lavare la griglia due volte toccando brevemente la sua superficie con una goccia d'acqua e asciugandola asciugandola entro pochi secondi. Dopo che l'acqua ha toccato brevemente la griglia fino a una goccia di macchia e asciugarla rapidamente. Utilizzando la stessa tecnica, lasciare che la griglia sia a contatto con una seconda goccia di macchia per 20 secondi.
Infine, asciugare all'aria la griglia sulla cappa da banco, o preferibilmente nel vuoto prima della sessione EM, controllare l'allineamento del microscopio EM caricando un file di allineamento perfezionato, se disponibile, dovrebbe ripristinarlo in condizioni quasi perfette. Caricare ora la griglia EM su un singolo portacampioni standard a inclinazione. Quindi, inserire il supporto nel tavolino.
Attendere quindi il completamento del ciclo di pompaggio e inserire il supporto nella colonna. Ora inizia a cercare un'area campione con una buona macchia. Messa a fuoco manuale utilizzando il metodo del contrasto minimo o utilizzando una telecamera CC, D e calcolando i quattro dal vivo.
Il tuo spettro di potenza. Quindi impostare la messa a fuoco profonda secondo necessità, di solito a una velocità negativa di 1,5 micron. La concentrazione della macchia può variare in tutta la griglia, quindi cerca proteine con contrasto bianco.
Evitare le aree con colorazione irregolare o positiva in cui il contrasto proteico diventa nero. Utilizzando l'approccio delineato per creare griglie e visualizzare campioni colorati negativamente. Diverse proteine familiari sono state visualizzate a scopo dimostrativo.
Prendi nota dei loro dettagli e del contrasto netto. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare campioni di macromolecole colorate negativamente per l'osservazione in un microscopio elettronico. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa quattro ore.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la ricostruzione 3D per comprendere meglio le strutture molecolari.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la visualizzazione di campioni proteici purificati utilizzando la microscopia elettronica a colorazione negativa (EM). Il metodo è accessibile agli utenti inesperti e funge da saggio di routine per l'analisi strutturale delle proteine.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Biologia Strutturale
- Microscopia Elettronica
- Analisi delle Proteine
Sfondo
- La colorazione negativa EM è una tecnica ampiamente utilizzata per la visualizzazione delle proteine.
- Consente un'analisi strutturale sia qualitativa che quantitativa.
- I protocolli per la preparazione del campione e la visualizzazione sono essenziali per un'applicazione di successo.
- Questo metodo può migliorare la comprensione delle strutture proteiche.
Obiettivo dello studio
- Fornire una guida completa per la preparazione delle griglie EM e la colorazione dei campioni.
- Dimostrare la visualizzazione delle proteine utilizzando la colorazione negativa EM.
- Facilitare l'uso di routine di questo metodo nell'analisi delle proteine.
Metodi utilizzati
- Preparazione delle griglie per microscopia elettronica.
- Applicazione della soluzione di colorazione negativa ai campioni proteici.
- Visualizzazione dei campioni in un microscopio elettronico.
- Registrazione delle immagini in condizioni ottimali.
Risultati principali
- Sono state ottenute immagini ad alto contrasto delle proteine.
- I protocolli dettagliati sono stati dimostrati con successo.
- Gli ausili visivi hanno migliorato la comprensione di passaggi complessi.
- I risultati supportano l'uso della colorazione negativa EM per l'analisi proteica di routine.
Conclusioni
- La colorazione negativa EM è un metodo efficace per la visualizzazione delle proteine.
- I protocolli forniti possono essere facilmente seguiti dagli utenti inesperti.
- Questa tecnica può completare altri saggi biochimici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Negative stain electron microscopy (EM) provides rapid, high-contrast visualization of purified proteins and macromolecular complexes, enabling early-stage assessment of sample quality and assembly state. This technique supports critical go/no-go decisions in discovery pipelines by confirming sample homogeneity and complex formation before resource-intensive downstream studies. Its accessibility and reproducibility make it a foundational tool for structural biology teams in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein complexes to confirm assembly and integrity.
- Supports rapid assessment of sample homogeneity, reducing ambiguity in target validation.
- Facilitates early detection of aggregation or degradation, de-risking downstream workflows.
- Provides visual evidence to support mechanistic hypotheses in target selection.
Screening & Assay Development
- Validates the quality of protein preparations prior to high-throughput screening or assay development.
- Ensures reproducibility and standardization of sample inputs for quantitative assays.
- Enables scalable preparation of validated EM grids for repeated use in screening campaigns.
- Supports reliable evaluation of compound effects on protein structure or assembly.
Translational & Preclinical Research
- Confirms structural integrity of therapeutic candidates prior to preclinical studies.
- Aligns visual data with biochemical and biophysical assays for translational continuity.
- Reduces risk of advancing structurally compromised candidates into preclinical models.
- Provides foundational data for subsequent 3D reconstruction and mechanistic studies.
Pipeline & Workflow Integration
Negative stain EM is positioned at the interface of protein purification and structural or functional characterization, bridging early discovery and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing protein complexes and assemblies.
- Screening: Confirms sample quality and reproducibility for downstream assays.
- Analytics: Provides high-contrast images for quantitative assessment of sample homogeneity and aggregation.
- Translational Research: Ensures structural fidelity of candidates entering preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, routine assay adaptable across diverse protein targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in sample quality and target validation.
- Operational Value: Delivers rapid, reproducible, and scalable visualization workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM grid preparation and instrument operation.
- Needs access to electron microscopy infrastructure and staining reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducible sample preparation and imaging.
- Adaptable to a wide range of protein sizes and complex types.
- Limited to surface visualization; not suitable for high-resolution internal structure analysis.
