Visualizzazione proteine e complessi macromolecolari di Negative EM Stain: dalla preparazione alla griglia Image Acquisition
22 dicembre 2011
Campioni di proteine di visualizzazione negativo microscopia elettronica macchia (EM) è diventato un metodo popolare di analisi strutturale. È utile per l'analisi quantitativa strutturale, come ad esempio calcolare una ricostruzione 3D delle molecole in fase di studio, e anche per l'esame qualitativo della qualità della preparazione delle proteine. In questo articolo presentiamo protocolli dettagliati per la preparazione delle griglie EM, colorazione del campione e visualizzando il campione in un microscopio elettronico. Gli utenti meno esperti possono seguire questi protocolli in modo semplice e di utilizzare negativo EM macchia come un test di routine, oltre ad altri saggi biochimici, per valutare i loro campioni di proteine.
L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare campioni proteici purificati mediante microscopia elettronica a contrasto negativo. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto le griglie per microscopia elettronica che sosterranno il campione. Il secondo passaggio della procedura consiste nella preparazione della soluzione di contrasto negativo.
Successivamente, il campione viene applicato sulla griglia per microscopia elettronica e colorato negativamente. Infine, la griglia per microscopia elettronica viene inserita in un microscopio elettronico e le immagini vengono acquisite in condizioni ottiche appropriate. Le immagini convenzionali in campo chiaro e in microscopia elettronica a contrasto di fase differenziale (DEM) presentano un alto contrasto e dettagli nitidi, mostrando singole macromolecole disperse su uno sfondo privo di caratteristiche distintive.
La microscopia elettronica con colorazione negativa è un metodo semplice per visualizzare la proteina di vostro interesse. Può essere utilizzata come saggio di routine per esaminare la proteina purificata, sia per analisi strutturale sia per altri saggi biochimici e biofisici. Qui di seguito illustriamo come preparare un campione con colorazione negativa per la microscopia elettronica.
La dimostrazione visiva di questo metodo è utile poiché alcuni passaggi sono difficili da apprendere solo tramite descrizioni testuali e figure. Iniziare utilizzando una pipetta di vetro per depositare una singola goccia di collodio in un grande becher contenente acqua, posizionandola sulla superficie dell'acqua. Mentre il collodio si espande, potrebbe intrappolare polvere presente sulla superficie dell'acqua.
Rimuovere e sostituire un film polveroso di collodio plastico con un'altra goccia. Successivamente, posizionare tra 50 e 100 griglie per microscopia elettronica una alla volta sul film plastico galleggiante, con il lato lucido rivolto verso il basso. Selezionare griglie a 400 maglie per la normale colorazione negativa e griglie a 200 maglie.
Per la raccolta di coppie di immagini inclinate. Selezionare un pezzo di carta non rugosa a bassa assorbenza leggermente più grande dell'area delle griglie. Posizionare la carta sopra le griglie e attendere finché la carta non diventa completamente bagnata.
La carta non deve assorbire l'acqua troppo rapidamente. Utilizziamo carta proveniente da un taccuino economico. Le griglie sono ora inserite tra la pellicola di plastica e la carta.
Utilizzare una pinza per posizionare il foglio in una piastra di Petri e farlo asciugare lentamente all'aria. Evitare metodi di essiccazione più rapidi poiché possono causare grinze. La macchina per rivestimento al carbonio utilizzata nel nostro laboratorio è un Creston 2 0 8 C high vacuum turbo carbon coer.
Dotato di un monitoraggio dello spessore del film Creston. Il monitoraggio utilizza un bilanciamento al quarzo sensibile ai depositi di carbonio. Tuttavia, il protocollo descritto qui non richiede questo dispositivo. Iniziare affilando e caricando le barrette di carbonio in una macchina per rivestimenti al carbonio.
Successivamente, rivestire una lametta di vetro con grasso da vuoto, lasciando metà della zona opaca non rivestita. Dopo il rivestimento con carbonio, le aree unte della lametta vengono utilizzate per stimare lo spessore del rivestimento di carbonio. Posizionare il foglio con le griglie sul portapreparati sotto il campana del macchinario per il rivestimento al carbonio. Posizionare la lametta unta.
Fai scorrere accanto alle griglie. Pompa la camera a vuoto fino a raggiungere almeno 10 microtorr, altrimenti le scintille genereranno molte particelle di grandi dimensioni sulla griglia. Aumenta ora molto lentamente la corrente.
La punta appuntita della barretta di carbonio diventerà estremamente luminosa. Non osservarla a occhio nudo quando inizia il rivestimento; la lametta di vetro cambierà colore assumendo una tonalità grigio scuro man mano che lo strato di carbonio si accumula. Interrompere la corrente quando si raggiunge lo spessore desiderato del rivestimento di carbonio, tenendo conto della trasparenza del barattolo a campana. Una volta calibrata la tonalità scura della lametta rispetto allo spessore del carbonio, questo metodo risulta accurato quanto il monitoraggio dello spessore del film, più costoso.
Al termine del processo, sfiatare la camera a vuoto ed estrarre le griglie rivestite per un uso successivo. Lo strato sottile di plastica non influirà sulla qualità dell'immagine ottenuta con la colorazione negativa, ma può essere rimosso immergendo le griglie in cloroformio per diverse ore prima di procedere. Preparare una soluzione fresca di formiato di uranile o utilizzare una soluzione conservata al buio da meno di due settimane.
Una soluzione fresca di buona qualità ha un colore giallo, un pH di circa quattro ed è priva di precipitati. Iniziare utilizzando un sistema disponibile in commercio per far brillare. Scaricare le griglie rivestite di carbonio.
Successivamente, posizionare due gocce da 20 microlitri di acqua distillata e due gocce da 25 microlitri di soluzione fresca di formiato urinario su un pezzo di perfil. Utilizzando pinzette antiriflusso ad azione capillare inversa, tenere una griglia precedentemente sottoposta a glow discharge, con il lato rivestito di carbonio rivolto verso l'alto. È fondamentale che queste pinzette non aspirino il liquido dalle griglie.
Ora applicare due microlitri del campione proteico sulla griglia e attendere l'assorbimento delle proteine nella griglia. Questo processo richiede tipicamente 30 secondi, ma campioni molto diluiti necessiteranno di più tempo, il che può influenzare le concentrazioni del buffer. Al termine, rimuovere il campione proteico tamponando con carta filtrante.
Quindi lavare la griglia due volte toccando brevemente la sua superficie con una goccia d'acqua e asciugandola con un batuffolo entro pochi secondi. Dopo che l'acqua ha toccato brevemente la griglia, metterla a contatto con una goccia di colorante e asciugarla rapidamente. Utilizzando la stessa tecnica, lasciare la griglia a contatto con una seconda goccia di colorante per 20 secondi.
Infine, lasciare asciugare all'aria la griglia nell'armadio a cappa oppure, preferibilmente, sotto vuoto prima della sessione al microscopio elettronico; verificare l'allineamento del microscopio elettronico caricando un file di allineamento ottimizzato, se disponibile, che dovrebbe ripristinarlo a una condizione prossima alla perfezione. A questo punto, caricare la griglia EM su un portacampioni standard con inclinazione singola. Successivamente, inserire il portacampioni nella fase.
Quindi attendere il completamento del ciclo di pompaggio e inserire il portacampioni nella colonna. Ora iniziare a cercare un'area del campione con una buona colorazione. Mettere a fuoco manualmente utilizzando il metodo del contrasto minimo o una telecamera CCD e calcolando l'immagine in tempo reale.
Il tuo spettro di potenza. Imposta quindi la messa a fuoco profonda secondo necessità, di solito a -1,5 micrometri. La concentrazione del colorante può variare sulla griglia, quindi cerca le proteine con contrasto bianco.
Evitare aree con colorazione irregolare o con colorazione positiva in cui il contrasto proteico diventa nero. Utilizzando l'approccio descritto per la preparazione delle griglie e la visualizzazione di campioni colorati negativamente, diverse proteine note sono state immaginate a scopo dimostrativo.
Prestare attenzione ai dettagli e al forte contrasto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare campioni di macromolecole negative da osservare al microscopio elettronico. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa quattro ore.
Dopo aver seguito questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la ricostruzione 3D per comprendere meglio le strutture molecolari.
Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo dettagliato per la visualizzazione di campioni proteici purificati mediante microscopia elettronica con colorazione negativa (EM). Il metodo è accessibile anche per utenti alle prime armi e rappresenta un saggio di routine per l'analisi strutturale delle proteine.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia Strutturale
- Microscopia Elettronica
- Analisi delle Proteine
Sfondo
- La microscopia elettronica con colorazione negativa è una tecnica ampiamente utilizzata per la visualizzazione delle proteine.
- Consente analisi strutturali sia qualitative che quantitative.
- I protocolli per la preparazione e la visualizzazione del campione sono essenziali per un'applicazione corretta.
- Questo metodo può migliorare la comprensione delle strutture proteiche.
Scopo dello studio
- Fornire una guida completa per la preparazione delle griglie per microscopia elettronica e la colorazione dei campioni.
- Dimostrare la visualizzazione delle proteine mediante microscopia elettronica a contrasto negativo.
- Facilitare l'uso routinario di questo metodo nell'analisi delle proteine.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di griglie per microscopia elettronica.
- Applicazione della soluzione di colorazione negativa ai campioni proteici.
- Visualizzazione dei campioni al microscopio elettronico.
- Acquisizione di immagini in condizioni ottimali.
Risultati principali
- Sono state ottenute immagini ad alto contrasto delle proteine.
- I protocolli dettagliati sono stati dimostrati con successo.
- Gli strumenti visivi hanno migliorato la comprensione dei passaggi complessi.
- I risultati supportano l'uso della microscopia elettronica con contrasto negativo per l'analisi routinaria delle proteine.
Conclusioni
- La microscopia elettronica con colorazione negativa è un metodo efficace per la visualizzazione delle proteine.
- I protocolli forniti possono essere facilmente seguiti da utenti alle prime armi.
- Questa tecnica può integrare altri saggi biochimici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microscopia elettronica con colorazione negativa (EM) consente una visualizzazione rapida e ad alto contrasto di proteine purificate e complessi macromolecolari, permettendo una valutazione precoce della qualità del campione e del suo stato di assemblaggio. Questa tecnica supporta decisioni critiche di avanzamento o interruzione nei percorsi di scoperta, confermando l'omogeneità del campione e la formazione di complessi prima di intraprendere studi successivi più dispendiosi in termini di risorse. La sua accessibilità e riproducibilità ne fanno uno strumento fondamentale per i team di biologia strutturale nell'ambito della ricerca biofarmaceutica&D.
Applicazioni Strategiche nella Biotecnologia Farmaceutica R&D
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette la visualizzazione diretta dei complessi proteici per confermarne l'assemblaggio e l'integrità.
- Consente una valutazione rapida dell'omogeneità del campione, riducendo l'ambiguità nella validazione della proteina bersaglio.
- Facilita il rilevamento precoce di aggregazione o degradazione, riducendo i rischi nei flussi di lavoro successivi.
- Fornisce evidenze visive a supporto di ipotesi meccanicistiche nella selezione del bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Verifica la qualità delle preparazioni proteiche prima dello screening ad alto rendimento o dello sviluppo di saggi.
- Garantisce la riproducibilità e la standardizzazione degli input campione per saggi quantitativi.
- Consente la preparazione su larga scala di griglie EM validate per un uso ripetuto nelle campagne di screening.
- Permette una valutazione affidabile degli effetti dei composti sulla struttura o sull'assemblaggio delle proteine.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Conferma l'integrità strutturale dei candidati terapeutici prima degli studi preclinici.
- Allinea i dati visivi con saggi biochimici e biofisici per garantire continuità traslazionale.
- Riduce il rischio di avanzare candidati strutturalmente compromessi nei modelli preclinici.
- Fornisce dati fondamentali per successive ricostruzioni tridimensionali e studi meccanicistici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La microscopia elettronica con colorazione negativa si colloca all'interfaccia tra la purificazione delle proteine e la caratterizzazione strutturale o funzionale, fungendo da ponte tra la fase iniziale della scoperta e la ricerca preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi mediante la visualizzazione di complessi e assemblaggi proteici.
- Screening: Conferma la qualità e la riproducibilità del campione per saggi successivi.
- Analisi: Fornisce immagini ad alto contrasto per la valutazione quantitativa dell'omogeneità del campione e dell'aggregazione.
- Ricerca traslazionale: Garantisce la fedeltà strutturale dei candidati che entrano nella validazione preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Offre un saggio standardizzato e di routine adattabile a diversi bersagli proteici e progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva sulla qualità del campione e sulla validazione dell'obiettivo.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro di visualizzazione rapidi, riproducibili e scalabili.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di avanzamento o interruzione e riduce i rischi biologici in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento di candidati con validazione strutturale, adeguati al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella preparazione delle griglie per microscopia elettronica e nell'uso dello strumento.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per microscopia elettronica e a reagenti per la colorazione.
- Richiede una standardizzazione tra team diversi per una preparazione e un'acquisizione delle immagini riproducibili.
- Adattabile a un'ampia gamma di dimensioni proteiche e tipi di complessi.
- Limitata alla visualizzazione della superficie; non adatta per l'analisi ad alta risoluzione delle strutture interne.
