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Neuroscienze
0 visualizzazioni • 5:18 min • June 17th, 2025
Prendete una larva di pesce zebra transgenico paralizzata montata in una camera di perfusione.
La larva esprime indicatori di calcio localizzati sulla membrana nelle cellule ciliate del neuromasta, un componente del sistema della linea laterale che rileva il movimento dell'acqua.
Le cellule ciliate comprendono fasci di capelli apicali e regioni presinaptiche basali, che formano sinapsi con i neuroni afferenti per trasmettere segnali.
Sotto un microscopio confocale, utilizzare un basso ingrandimento per posizionare una pipetta a getto di fluido vicino alla larva.
Aumentare l'ingrandimento per localizzare un neuromast, riposizionare la pipetta vicino ad esso e passare all'imaging a
fluorescenza.
Eroga impulsi fluidi per deviare i fasci di capelli, aprendo i canali di meccanotrasduzione per l'afflusso di cationi apicali, compresi gli ioni calcio.
Gli indicatori debolmente fluorescenti si legano al calcio, causando un aumento localizzato della fluorescenza.
L'afflusso cationico depolarizza la cellula, innescando l'ingresso di calcio attraverso canali voltaggio-dipendenti nella presinapsi basale, dove si lega agli indicatori e aumenta la fluorescenza localmente.
Visualizza la dinamica apicale e basale del calcio in tempo reale.
In questa procedura, riempire 10 microlitri di tampone neuronale in un ago a getto di fluido correttamente rotto utilizzando una punta di caricamento in gel. Caricare la soluzione in modo uniforme fino alla punta senza bolle. Quindi inserire l'ago nel portapipette fissato al micromanipolatore motorizzato.
Posizionare la camera di perfusione in un adattatore circolare sul tavolino del microscopio. Sposta il tavolino motorizzato in modo che la larva si trovi al centro del campo visivo. Successivamente, ruotare l'adattatore della camera circolare in modo che l'asse AP della larva sia approssimativamente allineato con la traiettoria dell'ago del getto del fluido.
Utilizzando la luce trasmessa e il contrasto di interferenza differenziale, metti a fuoco la larva e centralala sotto l'obiettivo 10x. Quindi aumenta l'obiettivo 10x. Utilizzando il micromanipolatore motorizzato, portare l'ago del getto del fluido verso il basso al centro del campo visivo, in modo che sia illuminato dalla luce trasmessa e tocchi appena il tampone neuronale.
Abbassa l'obiettivo 10x per concentrarti sulla larva al fine di confermare la sua posizione. Focalizzare l'obiettivo sull'ago del getto del fluido. Spostare l'ago del getto del fluido con il micromanipolatore sugli assi x e y fino a quando non si trova in posizione parallela al lato dorsale della larva.
Successivamente, concentrati di nuovo sulla larva. Abbassa l'ago sull'asse z e posiziona l'ago lungo il lato dorsale del pesce, a 1 millimetro di distanza dal corpo. Spostare con cautela l'adattatore della camera circolare per assicurarsi che l'ago del getto del fluido sia allineato lungo la linea mediana AP della larva.
Quindi, passa all'obiettivo acqua 60x. Assicurarsi che l'obiettivo sia immerso nel tampone neuronale. Usa la messa a fuoco fine per localizzare un neuromast. Successivamente, spostare il tavolino motorizzato per posizionare il neuroalbero di interesse al centro del campo visivo.
Tenere la punta dell'ago del getto fluido lungo il lato dorsale del pesce. Non toccare la punta dell'ago del getto fluido con la larva o la superficie della camera. Posizionare l'ago del getto del fluido con il micromanipolatore in modo che si trovi a 100 micrometri dal bordo esterno del neuroalbero.
Quindi concentrati fino alle punte dei fasci di peli apicali. La parte inferiore dell'ago del getto del fluido dovrebbe essere a fuoco in questo piano. Impostare la pinza di pressione ad alta velocità dalla modalità manuale a quella esterna per ricevere l'input dal software di imaging. Azzerare la pinza di pressione ad alta velocità premendo il pulsante zero e utilizzare la manopola del setpoint per impostare la pressione di riposo leggermente positiva. Confermare l'uscita di riposo della pinza di pressione ad alta velocità utilizzando un manometro PSI collegato all'uscita dello stadio principale.
Per determinare la pressione necessaria per stimolare i fasci di capelli, applicare uno stimolo di prova con un'uscita di 0,125 e 0,25 volt per 200-500 millisecondi. Per ogni stimolo del test, misurare la distanza di deflessione delle punte dei fasci di capelli (i kinocilia). Scegliere una pressione che sposti i fasci di una distanza di circa 5 micrometri. Assicurati che le punte della kinocilia rimangano a fuoco per tutto il tempo.
Per acquisire immagini su un singolo piano, selezionare uno stimolo da erogare durante l'acquisizione di 80 fotogrammi dopo il fotogramma 30 a tre secondi. Per misurare le risposte meccanosensibili al calcio, concentrarsi sulla base dei fasci di capelli apicali e avviare l'acquisizione dell'immagine. Per misurare le risposte presinaptiche del calcio, concentrarsi sulla base delle cellule ciliate e avviare l'acquisizione dell'immagine.