Caratterizzazione delle giunzioni neuromuscolari nei topi mediante microscopia combinata confocale e a super-risoluzione

Iniziare con fibre muscolari murine fissate chimicamente e permeabilizzate posizionate nei pozzetti di una piastra multipozzetto.

Incubare in una soluzione bloccante per ridurre al minimo il legame di anticorpi non specifici.

Aggiungere anticorpi primari che hanno come bersaglio una proteina presinaptica espressa alla giunzione neuromuscolare o NMJ.

Lavare con tampone per rimuovere gli anticorpi non legati.

Incubare con anticorpi secondari coniugati con fluorofori che hanno come bersaglio gli anticorpi primari e una neurotossina coniugata con fluorofori che si lega ai recettori postsinaptici dell'acetilcolina.

Lavare con tampone per rimuovere i reagenti non legati.

Posizionare le fibre su un vetrino con supporti di montaggio, posizionare un vetrino coprioggetti e fissarle con magneti cilindrici per appiattire le fibre.

Iniziare l'imaging utilizzando un microscopio confocale-STED.

Dopo l'illuminazione laser, le proteine marcate diventano fluorescenti.

La

microscopia confocale non riesce a risolvere con chiarezza le strutture NMJ più fini a causa della sua risoluzione limitata e della diffusione della fluorescenza.

Al contrario, la microscopia STED utilizza un laser a deplezione per sopprimere