JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:33 min • June 17th, 2025
Prelevare un vetrino coprioggetti rivestito di polimero contenente una coltura mista di neurone-astrociti nella camera di registrazione.
Queste cellule trasfettate esprimono proteine sensibili al calcio sul plasma e sulle membrane dell'ER, fluorescenti al legame con il calcio per tracciare la dinamica subcellulare del calcio.
Aggiungere terreni contenenti ioni calcio e coprire la camera per evitare l'evaporazione.
Posizionare la camera sotto un microscopio a fluorescenza.
Gli ioni calcio si legano alle proteine sensibili al calcio. Dopo l'irradiazione con luce blu, le proteine sensibili al calcio sulla membrana esterna dell'ER diventano fluorescenti in verde. Usa questa fluorescenza verde per localizzare gli astrociti.
Quindi, irradiare con luce verde. Le proteine sensibili al calcio sulla membrana plasmatica emettono fluorescenza in rosso. Confermare la presenza di fluorescenza rossa nello stesso astrocita che mostra fluorescenza verde.
Registra immagini time-lapse di proteine sensibili al calcio sulla membrana plasmatica, seguite dalle proteine sensibili al calcio sulla membrana esterna dell'ER.
Analizza le immagini per osservare l'attività spontanea del calcio specifica del compartimento nell'astrocita selezionato.
Montare il vetrino coprioggetti contenente le cellule trasfettate con Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f nella camera di registrazione del microscopio. Aggiungere 400 microlitri di supporto di imaging e posizionare un coperchio sopra la camera. Scegli il set di filtri per GCaMP6f e la sorgente luminosa. Localizzare gli astrociti che esprimono OER-GCaMP6f.
Quindi, scegli un set di filtri e una sorgente luminosa per RCaMP2. E confermare se Lck-RCaMP2 è espresso negli stessi astrociti. Registra immagini time lapse di Lck-RCaMP2 a 2 hertz per due minuti e salva i dati di imaging.
Dopodiché, modificare nuovamente il filtro impostato su quello per GCaMP6f. Registra immagini time lapse di OER-GCaMP6f a 2 hertz per due minuti. Quindi salvare i dati di imaging.