Name: Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Impara a derivare progenitori neuronali da cellule staminali embrionali umane mediante induzione con piccole molecole. Questo protocollo efficiente genera neuroblasti e neuroni maturi per applicazioni di riparazione neurale.

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XHP è stato sostenuto dal National Institute of Health (NIH) sovvenzioni da National Institute on Aging (NIHK01AG024496) e The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano (NIHR21HD056530).

1. Soluzione e Media Preparazione <ol><li> Rivestimento in gelatina soluzione: 0,1% (w / v) gelatina in DDH 2 O, autoclave e conservare a 4 ° C. </li><li> Matrigel rivestimento soluzioni. Soluzione: lento disgelo Matrigel (10 ml) a 4 ° C per una notte, aggiungere 10 ml ghiacciata DMEM o DMEM/F12, mescolare bene e aliquota 1 ml / tubo sotto cappuccio tessuto sterilizzato cultura, conservare a -20 ° C. Soluzione di lavoro: lento disgelo 1 ml aliquota Matrigel a 4 ° C per 1-2 ore, il trasferimento di 14 ml o refrigerata DMEM DMEM/F12 e mescolare bene sotto cappa sterile cultura del tessuto immediatamente prima del rivestimento. </li><li> Umano laminina soluzione di rivestimento: diluire 1 ml di soluzione umana laminina (0,5 mg / ml in Tris tamponata NaCl, conservare a -80 ° C, lento disgelo a 4 ° C per 1-2 ore) con gelida DMEM o DMEM/F12 a 12,5 ml soluzione di lavoro (40 mcg / ml) sotto cappa sterile cultura del tessuto immediatamente prima del rivestimento. </li><li> Fattore di crescita soluzioni madri (500-1000X): sciogliere il fattore di crescita a 10 mcg/ Ml in tampone sterile (0,5% di BSA, 1,0 mM DTT, 10% glicerolo, 1XPBS) e di memorizzare fino a 50-100 microlitri / tubo aliquote a -80 ° C. </li><li> Tutte le trans retinoico soluzione di lavoro (1000X): 10 mM in DMSO, conservare in aliquote a -80 ° C. </li><li> Mezzi di comunicazione HESC: DMEM/F12 o KO-DMEM (80%), KO sostituzione del siero (20%), L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm), MEM acidi aminoacidi non essenziali (MNAA, 1X), e β-mercaptoetanolo (100 micron), filtrare e conservare a 4 ° C, integrato con 20 ng / ml bFGF prima dell'uso. O la sostituzione di "knock out (KO) la sostituzione del siero" con componenti definiti: DMEM/F12 o KO-DMEM (100%), L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm), MNAA (1X), MEM essenziale amminoacidi (MEAA, 1X) e β-mercaptoetanolo (100 micron), filtrata e conservare a 4 ° C, integrato con bFGF (20 ng / ml), l'insulina umana (20 mg / ml), acido ascorbico (50 mg / ml), umano activina A (50 ng / ml), albumina umana / Albumax (10 mg / ml), e transferrina umana (8 mcg / ml) prima dell'uso. </li><li> NSC media: DMEM/F12 (100%), N-2 supplement (1X), l'eparina (8 mcg / ml). </li></ol> 2. Lastra di rivestimento <ol><li> Piastre cappotto con gelatina: aggiungere 2,5 ml / pozzetto di soluzione di gelatina a 6 piastre ed incubare una notte a 37 ° C incubatore umidificato. </li><li> Piastre cappotto con laminina: chill gelatina rivestite piatti e rimuovere la gelatina, aggiungere 2,5 ml / o umani e Matrigel soluzione di rivestimento laminina lavoro di pre-refrigerata gelatinizzato 6 pozzetti ed incubare a 4 ° C durante la notte. </li></ol> 3. Passaging e semina hESC indifferenziato in condizioni definite <ol><li> Lasciare colonie hESC crescere fino a 5-7 giorni vecchi, e prendere la cultura piastra hESC a microscopio da dissezione (pre-riscaldare dissezione fase a 37 ° C) sotto cappa sterile dissezione. </li><li> Seleziona colonie hESC da dividere. Morfologicamente, queste colonie avrebbero dovuto&gt; hESC 75% indifferenziato (piccole celle compatte), di solito leggermente opaco (non bianco-ammucchiati cellule non differenziate cellule chiare) con bordo ONU definitoderneath il microscopio da dissezione. Attentamente delineare le colonie selezionate e rimuovere strato differenziato dei fibroblasti che circonda la colonia e tutte le parti differenziate (se presente) della colonia con il bordo della P2 punta pipetta sterile o tirato capillare di vetro. (Si prega di notare, hESC pluripotenti sono in una fase transitoria, subiscono differenziazione spontanea anche in condizioni ottimali, anche se si preferisce, è difficile accertare le cellule tesi sono al 100% indifferenziato sotto microscopio da dissezione,&gt; 75% indifferenziati vengono solitamente considerati come il punto di passaggio. L' cellule differenziate di solito non di semi e continuare a crescere, eliminati nel processo di passaging) </li><li> Rimuovere i vecchi media mobile contenente le cellule differenziate staccato da aspirazione. Lavare con i media hESC (senza bFGF) una volta. Aggiungere 3 ml / media hESC ben fresco contenente 20 ng / ml bFGF. </li><li> Tagliare le colonie hESC indifferenziato in piccoli pezzi, e staccare con la punta della pipetta sterile o vetro tirato capillare.</li><li> Piscina i supporti contenenti pezzi staccati colonia insieme in un tubo da 50 ml. Lavare la piastra una volta con 1 ml / media hESC pozzetto contenente 20 ng / ml bFGF e piscina insieme. </li><li> Aspirare il Matrigel o umano soluzione laminina dalle piastre rivestito fresca. Aliquota 4 ml / pozzetto contenente pezzi dei media hESC colonia di un 6-pozzetti. Delicatamente trasferire la piastra per incubatore senza agitare e lasciare colonia semi di pezzi durante la notte senza disturbare umidificata in un incubatore a 37 ° C con una atmosfera di 5% di CO 2. </li></ol> 4. Induzione neurale di hESC in Sistema Cultura Definito con Acido Retinoico <ol><li> Al 3 ° giorno dopo la semina, rimuovere la maggior parte dei vecchi media da ciascun pozzetto della piastra e di lasciare i supporti a sufficienza per permettere colonie hESC di essere sommersa (mai permettere hESC ad asciugarsi). Sostituire con 4 ml / media hESC ben fresco contenente 20 ng / ml bFGF e 10 mM acido retinoico. </li><li> Sostituire vecchi media con i media hESC fresca contenente 20 ng / ml bFGF e10 mM acido retinoico a giorni alterni, e permettere neurali indotti colonie hESC crescere fino a giorno 7 o 8. Tutte le cellule all'interno della colonia subirà cambiamenti morfologia a grandi cellule differenziate che continueranno a moltiplicarsi. Le colonie aumenteranno di dimensioni per coprire la piastra di giorno 7 o 8, e le cellule cominceranno ad accumularsi in alcune aree delle colonie. </li></ol> 5. Continuando differenziamento neuronale in Cultura Sospensione <ol><li> Prendere la cultura piastra hESC microscopio a dissezione (pre-riscaldare dissezione fase a 37 ° C) sotto cappa sterile dissezione. Attentamente delineare le colonie e rimuovere strato di fibroblasti che circonda la colonia (cellule differenziate migrate dalla colonia) con il bordo della P2 puntale sterile o tirato capillare di vetro. </li><li> Rimuovere i vecchi media mobile contenente cellule di fibroblasti staccato da aspirazione. Lavare con i media hESC (senza bFGF) una volta. Aggiungere 3 ml / media hESC ben fresco (senza bFGF). </li><li> Tagliare il neurali-icolonie hESC nduced in piccoli pezzi, e staccare con la punta della pipetta sterile o tirato capillare di vetro. </li><li> Piscina i supporti contenenti pezzi staccati colonia insieme in un tubo da 50 ml. Lavare la piastra una volta con 1 ml / media hESC bene (senza bFGF) e piscina insieme. </li><li> Aliquota 4 ml / e senza siero hESC supporti contenenti pezzi colonia di un 6-pozzetti bassissimo attaccamento e incubare a 37 ° C umidificata incubatore per consentire galleggiante ammassi cellulari (neuroblasti) per formare per 4-5 giorni. </li></ol> 6. Fenotipo maturazione neuronale nella cultura adesivo <ol><li> Piscina i supporti contenenti neuroblasti galleggiante insieme in un tubo da 50 ml. Centrifugare a 1400 rpm per 5 min. Aspirare il vecchi media per quanto è possibile e aggiungere pari quantità di fresca NSC supporti contenenti VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), e BDNF (10 ng / ml). </li><li> Pipetta su e giù per miscelare neuroblasti galleggianti e aliquota 4 ml / pozzetto a 6-pozzetti. Il neuroblasti può anche essere séeded in un laminina laminina / collagene (Matrigel) o umana polimerizzati 3-dimensionale matrice nel siero senza mezzi NSC contenenti VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), e BDNF (10 ng / ml) . Trasferire le piastre a 37 ° C in incubatore umidificato per consentire neuroblasti di allegare tutta la notte. </li><li> Sostituire NSC supporti contenenti VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), e BDNF (10 ng / ml) a giorni alterni. Vaste reti di cellule neuronali dei neuriti portanti e cellule pigmentate cominceranno a comparire entro 2 settimane di coltivazione continua e aumento del numero con il tempo, e potrebbe essere sostenuta per oltre 3 mesi. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: L'acido retinoico (RA) è reso sufficiente a indurre hESC mantenuto nel sistema cultura definita la transizione da pluripotenza esclusivamente ad un fenotipo neuroectodermici (Fig. 2A). In caso di esposizione di hESC indifferenziato a RA, tutte le cellule all'interno della colonia subirà cambiamenti di morfologiagrandi cellule differenziate che cessano esprimere pluripotenza associati marcatori, come indicato dalla Oct-4, e cominciare a esprimere diverse neuroectoderma associati marcatori, come HNK1, AP2, e TRKC (Fig. 2B). Queste cellule differenziate grandi continueranno a moltiplicarsi e le colonie aumenteranno di dimensione, di procedere spontaneamente per esprimere il marker precoce neuronale β-III-tubulina (fig. 2B). Il marcatore più maturo neuronale Mappa-2 si cominciano ad apparire nelle aree delle colonie dove le cellule si sono accumulati (Fig. 2B). In coincidenza con la comparsa delle cellule neuroectodermici e la differenziazione neuronale, il meccanismo neuronale specifico fattore trascrizionale Nurr1, implicato nella differenziazione dei neuroni dopaminergici e l'attivazione della tirosina idrossilasi (TH) del gene 16, sarà traslocare al nucleo (Fig. 2B). Dopo aver staccato la hESC RA trattati formeranno galleggiante ammassi cellulari (neuroblasti) in una setta sospensioneure per continuare il processo di differenziazione neuronale. Dopo la rimozione di bFGF e dopo permettendo neuroblasti per collegare ad una piastra di coltura tissutale o seminati in un laminina / collagene polimerizzato 3-dimensionale matrice di un siero privo di un terreno specifico, β-III-tubulina e mappa-2-esprimere, neuriti portante cellule e cellule pigmentate inizieranno ad apparire con un drastico aumento di efficienza rispetto ai spontanea multi-lignaggio differenziazione delle hESC senza trattamento nel periodo di tempo stesso, e potrebbe essere sostenuta per oltre 3 mesi (Fig. 2C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Uno schema di ben controllata induzione efficiente delle cellule staminali umane pluripotenti esclusivamente ad una particolare stirpe clinicamente rilevanti da semplice disposizione di piccole molecole. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 (A) Schema raffigurante della linea Time Protocol of diretto differenziazione neuronale di hESC. (B) Dopo l'esposizione di hESC indifferenziato ad acido retinoico (RA) nell'ambito del sistema cultura definita, grande differenziati ottobre-4 (rosso), le cellule negative all'interno della colonia ha cominciato ad emergere, rispetto ai mock-trattati (DMSO) hESC come il controllo . RA-indotta delle cellule differenziate ottobre-4-negativi cominciarono a esprimere HNK-1 (rossa), AP2 (rosso), TRKC (verde), e poi β-III-tubulina (rosso), in linea con primi differenziazione neuroectodermici. Queste cellule hanno continuato a maturare in ultima analisi, che esprimono il marcatore neuronale Map-2 (verde), di solito in aree in cui cellule hanno cominciato ad accumularsi. In coincidenza con la comparsa delle cellule neuroectodermici e la differenziazione neuronale, il meccanismo neuronale specifico fattore trascrizionale Nurr1 (verde), implicato indopaminergici differenziazione neuronale e l'attivazione della tirosina idrossilasi (TH) del gene, traslocato al nucleo. Tutte le cellule sono mostrati dalla colorazione DAPI dei loro nuclei (blu). (C) il trattamento con RA induce la differenziazione verso una linea neuronale ad alta efficienza come dimostrato dalle reti estese di neuriti-cuscinetto cellule che esprimono β-III-tubulina (in rosso) e mappa-2 (verde, mostrata in un 3-dimensionali matrice). Le frecce indicano le cellule pigmentate tipico di quelli del sistema nervoso centrale. Tutte le cellule sono mostrati dalla colorazione DAPI dei loro nuclei (blu) in riquadri. Barre di scala: 0,1 mm.

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</ol>

Gli autori dichiarano interessi in competizione. XHP è il fondatore di Xcelthera. XHP e EYS hanno proprietà intellettuale relativi alle hESC.

Una delle sfide più importanti sia per lo studio dello sviluppo e la traduzione clinica è stata come incanalare le ampie potenzialità di differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti da un fenotipo desiderato in modo efficiente e prevedibile. Anche se tali cellule possono differenziarsi spontaneamente in vitro in cellule di tutti gli strati germinali passando attraverso un multi-stadio lignaggio aggregato, solo una piccola frazione di cellule perseguire un 1,4 lignaggio dato. In questi hESC derivati ​​aggregati, la simultanea comparsa di una notevole quantità di ampiamente divergenti tipi di cellule indesiderate che possono risiedere in tre strati germinali embrionali rende spesso la comparsa di fenotipi desiderati non solo inefficiente, ma incontrollabile e inaffidabile pure. Anche se lignaggi cardiache e neuronali sono stati ottenuti in precedenti relazioni, tuttavia, l&#39;inefficienza nella generazione di cellule specializzate attraverso strato germinale, l&#39;induzione di cellule pluripotenti e l&#39;alto rischio di cancerogenicità a seguito transplantation hanno impedito ulteriori traduzioni cliniche. Le linee di hESC inizialmente sono stati ottenuti e mantenuti in co-coltura con una crescita arrestato topo fibroblasti embrionali (MEF) 4. Anche se molti di alimentazione umana, senza alimentatore, e sistemi di coltura chimicamente formulati sono stati sviluppati per hESC 11-13, gli elementi necessari e sufficienti per sostenere l&#39;auto-rinnovamento delle cellule pluripotenti umane restano irrisolti. Queste cellule alimentatore esogeni e reagenti biologici aiutano a mantenere la crescita a lungo termine stabile di hESC indifferenziata, mentre la maschera la capacità delle cellule pluripotenti di rispondere ai segnali di sviluppo. Mantenere hESC indifferenziato in un definito biologici sistema privo di cultura che consente l&#39;espansione fedeli e controllabili differenziazione diretta è una delle chiavi per la loro utilità e le potenzialità terapeutiche. RA non era sufficiente a indurre la differenziazione neuronale di hESC indifferenziato mantenuto sotto condiz precedentemente riportatoioni contenenti cellule alimentatore esogeni. Anche se lignaggi neurale compaiono in una fase relativamente precoce nella differenziazione hESC, trattando hESC differenziato multi-lignaggio aggregati (corpi embrionali) con artrite reumatoide solo leggermente aumentato la bassa resa dei neuroni 1, 14, 15. Per raggiungere in modo uniforme la conversione di cellule staminali umane pluripotenti da una stirpe particolare, abbiamo impiegato un sistema di coltura definito in grado di assicurare la proliferazione di hESC indifferenziato per identificare le condizioni per ben controllata induzione efficiente delle hESC pluripotenti esclusivamente ad una particolare stirpe clinicamente rilevanti dalla semplice fornitura di piccole molecole (Fig. 1, fig. 2). Studi futuri rivelerà molecole controllo genetico ed epigenetico dello sviluppo umano nel sistema nervoso centrale come alternative, che possono aprire la strada a piccole molecole-mediata controllo diretto e la modulazione del destino hESC quando pluripotenti derivanti lignaggi clinicamente rilevanti per terapie rigenerative. Senza trattamento con RA, 1-5HESC% sarà oggetto di differenziazione spontanea in neuroni 1, 14, 15. Con il trattamento con RA, siamo stati in grado di generare&gt; 95% progenitori embrionali neuronali ed i neuroni dalle hESC mantenuto nell&#39;ambito di una definizione di cultura in un processo che potrebbe emulare sviluppo embrionale umano 14. Recentemente, noto neurali destino determinare i geni sono stati utilizzati per transdifferenziarsi fibroblasti di topo adulto in progenitori neurali e dei neuroni con un basso livello di efficienza che vanno 0,5-8% 17, 18. Tuttavia, riprogrammato le cellule somatiche sono state storicamente associato con l&#39;espressione genica anormale e senescenza accelerata con compromissione della utilità terapeutica 19-21. Infine, il protocollo abbiamo stabilito qui è limitato alle hESC pluripotenti derivate dalla massa cellulare interna (ICM) o epiblast della blastocisti umana 4, non possono applicarsi a cellule pluripotenti altri, tra cui origine animale-CES, CES derivati ​​da precedenti morula (otto celle) embrioni allo stadio 22, e artificially cellule riprogrammate 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> Bioscienze BD </td><td> 356231 </td><td> Fattore di crescita ridotta </td></tr><tr><td> Umano laminina </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> all trans retinoico </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565018 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out sostituzione siero </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM soluzione di aminoacidi non essenziali (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM unoMino acidi soluzione (MEAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Acido ascorbico </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Transferrina umana </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> BFGF umano </td><td> Peprotech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;insulina umana </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Un umano activina </td><td> Peprotech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> Umano BDNF </td><td> Peprotech </td><td> AF-450-02 </td><td></td></tr><tr><td> VEGF umano </td><td> Peprotech </td><td> AF-100-20 </td><td></td></tr><tr><td> Umano NT-3 </td><td> Peprotech </td><td> 450-03 </td><td></td></tr><tr><td> Eparina </td&gt; <td> Sigma </td><td> H5284 </td><td></td></tr><tr><td> N-2 supplemento (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td><td></td></tr><tr><td> 6-ben ultrabassa piastra di fissaggio </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6 pozzetti </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

C&#39;è un grande bisogno insoddisfatto di una clinicamente adeguata fonte di cellule neuronali umane per la riparazione o rigenerazione del danneggiato sistema nervoso centrale (SNC) struttura e circuiti nel settore sanitario di oggi. Terapie basate sulle cellule sono molto promettenti per ripristinare il tessuto nervoso e la funzione perduta per i disturbi del sistema nervoso centrale. Tuttavia, terapie cellulari basate sul sistema nervoso centrale, cellule staminali neurali hanno incontrato limitazioni e difficoltà di alimentazione da utilizzare in ambito clinico grazie alla loro capacità di espansione limitata di cultura e di plasticità, dopo non aver esteso 1-3 passaging. Nonostante alcuni risultati positivi, il CNS-derivato cellule staminali neurali (hNSCs) sembrano esercitare i loro effetti terapeutici principalmente dalla loro progenie non neuronali attraverso la produzione trofica e le molecole neuroprotettive per salvare le cellule endogene 1-3. In alternativa, pluripotenti le cellule staminali embrionali umane (hESC) proffer cure per una vasta gamma di disturbi neurologici da supplying la diversità dei tipi di cellule umane neuronali del sistema nervoso centrale di sviluppo per la rigenerazione 1,4-7. Tuttavia, come incanalare il potenziale ampia differenziazione delle hESC pluripotenti in modo efficiente e prevedibile di un fenotipo desiderato è stato una grande sfida sia per lo studio e la traduzione di sviluppo clinico. Approcci convenzionali si basano su multi-lignaggio inclinazione di cellule pluripotenti attraverso la differenziazione spontanea foglietto embrionale, con conseguente inefficienza e incontrollabile lignaggio impegno che viene spesso seguita da eterogeneità fenotipica e instabilità, di conseguenza, un elevato rischio di tumorigenicità 7-10. Inoltre, non definito integratori stranieri / animale biologica e / o alimentatori che sono stati generalmente utilizzati per l&#39;isolamento, l&#39;espansione e la differenziazione delle hESC può utilizzarli direttamente di tali cellule specializzate innesti nei pazienti problematici 11-13. Per superare questi ostacoli, abbiamo risolto gli elementi di un sistema di coltura definito necessaria e sufficiente per sustaining il pluripotence epiblast di hESC, che funge da piattaforma per la derivazione de novo di hESC clinicamente adeguata ed efficace regia hESC quali uniformemente verso lignaggi clinicamente rilevanti da piccole molecole 14 (vedere uno schema in figura. 1). L&#39;acido retinoico (RA) non induce la differenziazione neuronale di hESC indifferenziata mantenuta su linee 1, 14. E a differenza di CES del mouse, trattando corpi embrionali hESC differenziato (EBS) solo leggermente aumenta la bassa resa dei neuroni 1, 14, 15. Tuttavia, dopo lo screening di una serie di piccole molecole e fattori di crescita, abbiamo riscontrato che tali condizioni definite reso acido retinoico (RA) sufficiente a indurre le specifiche del neuroectoderma diretto da hESC pluripotenti che ulteriormente progredita al neuroblasti che ha generato umano progenitori neuronali ed i neuroni nel SNC di sviluppo con alta efficienza (Fig. 2). Abbiamo definito le condizioni per l&#39;induzione della neuroesplosioni diretto da hESC pluripotenti senza un intervento a più fasi embrionali lignaggio corpo, consentendo ben controllati derivazione efficiente di una grande quantità di cellule neuronali tutta la gamma di stadi di sviluppo per le terapie basate sulle cellule.

Abbiamo stabilito un protocollo per l&#39;induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Esiste un ampio e insoddisfatto bisogno di una fonte di cellule neuronali umane clinicamente idonea per la riparazione o la rigenerazione del sistema nervoso centrale danneggiato...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere progenie neuronali direttamente ed esclusivamente da cellule staminali embrionali umane pluripotenti mediante induzione con molecole di piccole dimensioni. Questo risultato si ottiene aggiungendo acido retinoico a cellule non differenziate mantenute in condizioni definite. Successivamente, il processo di differenziazione prosegue staccando le cellule in una coltura in sospensione, dove formano aggregati cellulari sospesi chiamati neuroblasti.Se si permette alle neuroblaste di aderire a una piastra per colture cellulari in un mezzo di differenziamento neuronale, esse sviluppano caratteristiche di neuroni maturi. In definitiva, l'immunofluorescenza e la microscopia a deconvoluzione o confocale possono essere utilizzate per mostrare l'effetto del trattamento con acido retinoico sulla morfologia e sull'espressione dei marcatori nelle cellule staminali embrionali umane trattate. Con altre tecniche, solo una piccola frazione di cellule assume un fenotipo neuronale, mentre il nostro metodo consente un'induzione efficiente e ben controllata delle cellule staminali embrionali umane pluripotenti esclusivamente verso una linea neuronale mediante l'aggiunta semplice di piccole molecole.Vi sono alcuni passaggi da eseguire con attenzione durante la preparazione delle soluzioni stock. Scongelare lentamente il matrigel e la laminina umana da meno 80 gradi Celsius a quattro gradi Celsius durante la notte, conservare il mezzo a quattro gradi Celsius e riscaldarlo sempre a 37 gradi Celsius prima dell'uso. Inoltre, quando si prepara il mezzo per cellule staminali embrionali umane, alcuni supplementi vanno aggiunti immediatamente prima dell'uso.Questi includono BFGF, acido ascorbico, insulina umana attiva in A e transferrina. Successivamente, preparare immediatamente prima del rivestimento delle piastre la soluzione lavorativa di matrigel o laminina umana. Incubare le piastre a 37 gradi SIUs in presenza di 5% di anidride carbonica dopo aver preparato le piastre per colture cellulari pre-rivestite con gelatina.La gelatina può essere sostituita dalla soluzione lavorativa di matrigel o laminina. Rivestire queste piastre incubandole tutta la notte a quattro gradi Celsius. Iniziare permettendo alle colonie di cellule staminali umane di crescere per cinque a sette giorni e quindi prepararsi a suddividerle.Selezionare alcune colonie con oltre il 75% di cellule staminali umane indifferenziate; di solito sono leggermente opache, con bordi ben definiti e contengono cellule accumulate. Un segnale dell'inizio della differenziazione è solitamente rappresentato da colonie bianche; le colonie contenenti prevalentemente cellule differenziate appaiono invece trasparenti. Non selezionare colonie bianche o trasparenti.Tenere le piastre alla luce e utilizzare un pennarello per delineare le colonie leggermente opache sul fondo delle piastre seguendo i contorni. Utilizzare il bordo di una punta sterile per pipetta P2 per staccare lo strato di fibroblasti circostante dalla colonia di cellule staminali embrionali umane. Rimuovere quindi i fibroblasti circostanti e tutte le parti differenziate della colonia.Ora aspirare il vecchio mezzo contenente le cellule differenziate staccate. Successivamente, in ogni pozzetto lavare una volta le cellule indifferenziate con mezzo per cellule staminali umane E privo di BFGF, quindi aggiungere tre millilitri di mezzo fresco per cellule staminali umane contenente B-F-G-F; il B-F-G-F viene aggiunto al mezzo fresco immediatamente prima dell'uso. Ora utilizzare una punta sterile per pipetta P2 per tagliare le colonie in piccoli pezzi e staccarle dalla piastra.Trasferire i frammenti di colonia staccati con il loro mezzo in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere un ulteriore millilitro di mezzo come risciacquo per ogni pozzetto.Le cellule sono ora pronte per ulteriori differenziazioni mediante l'uso di molecole di piccole dimensioni. Riscaldare innanzitutto le piastre appena rivestite a 37 gradi Celsius. Aspirare la soluzione di rivestimento dalle piastre e aggiungere un'aliquote di quattro millilitri di mezzo contenente frammenti di colonie in ciascun pozzetto, quindi trasferire delicatamente le piastre nell'incubatore senza agitarle.Non disturbare le piastre in modo che possano avvenire l'adesione. Dopo tre giorni di adesione, preparare un nuovo mezzo contenente acido omico. Quindi rimuovere la maggior parte del vecchio mezzo, lasciando solo una quantità sufficiente di mezzo perché le cellule rimangano immerse.Le cellule non devono mai essere lasciate asciugare. Aggiungere quattro millilitri di mezzo fresco per cellule staminali umane contenente BFGF e acido rettinoico. Sostituire il mezzo ogni due giorni e lasciare crescere le colonie di cellule staminali umane trattate con acido rettinoico.Dopo sette o otto giorni, le cellule avranno subito cambiamenti morfologici trasformandosi in grandi cellule differenziate. Procedere quindi con la preparazione di una coltura cellulare in sospensione: per iniziare la coltura in sospensione, staccare le colonie di ESL dalle cellule che si sono differenziate spontaneamente e migrate formando uno strato di fibroblasti. Utilizzare la tecnica sopra descritta con una punta di pipetta sterile, quindi aspirare il vecchio mezzo contenente le cellule di fibroblasti staccate e in sospensione.Lavare le cellule una volta con il mezzo per hESC e ri-sospendere le cellule in tre millilitri di mezzo per hESC. Utilizzando ora una punta sterile per pipetta P2, tagliare le colonie in piccoli pezzi e staccarle dalla piastra.Trasferire il mezzo con le colonie staccate in un singolo tubo conico da 50 millilitri. Lavare le pozzette con un millilitro di mezzo e aggiungere il lavaggio al pool. Successivamente, aliquotare quattro millilitri delle cellule raggruppate in ciascuna pozzetta di una piastra a sei pozzette con superficie ultra-bassa di adesione per quattro-cinque giorni, mantenendo la piastra in un incubatore.In questo periodo, si formeranno aggregati cellulari galleggianti o neuroblasti che permetteranno un'ulteriore maturazione del neuroblasta verso un fenotipo neuronale più maturo. Trasferire il mezzo contenente questi elementi in un tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, centrifugare le cellule a 1.400 giri al minuto per cinque minuti.Aspirare, pesare la maggior quantità possibile del vecchio mezzo e aggiungere una quantità uguale di mezzo NSC fresco contenente VEGF N NT three e BDNF. Sospendere le cellule mediante pipettaggio, quindi aliquotare quattro millilitri di sospensione per pozzetto in piastre per colture cellulari a sei pozzetti. Trasferire le piastre in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius.Il neuroblastoma aderirà alle piastre di coltura per tutta la notte per una coltura 3D su Matrigel o laminina umana aggiunta alla sospensione di neuroblastomi. E una matrice 3D polimerizzerà a 37 gradi Celsius. Sostituire il mezzo ogni due giorni.Entro due settimane, appariranno estese reti di cellule neuronali portatrici di neuriti e cellule pigmentate; l'acido retinoico risulta sufficiente per indurre le cellule staminali embrionali umane mantenute nel sistema di coltura definito a passare dalla pluripotenza esclusivamente a un fenotipo neuroepidermico. A seguito dell'esposizione di cellule staminali embrionali umane indifferenziate all'acido retinoico, tutte le cellule all'interno della colonia subiscono cambiamenti morfologici, trasformandosi in grandi cellule differenziate che cessano di esprimere il marcatore associato alla pluripotenza OCT4. Le cellule iniziano inoltre ad esprimere diversi marcatori associati al neuroectoderma, come HNK-1a, P2 e TRKC.Queste grandi cellule differenziate hanno continuato a moltiplicarsi e le colonie sono aumentate di dimensione, esprimendo spontaneamente il marcatore neuronale precoce beta tre tubulina. Il marcatore neuronale più maturo map due ha cominciato ad apparire nelle aree delle colonie in cui le cellule si erano accumulate. Contestualmente all'apparizione delle cellule neuroectodermiche, il fattore di trascrizione neuronale specifico NER uno, implicato nella differenziazione neuronale dopaminergica e nell'attivazione del gene della tirosina idrossilasi, si è traslocato nel nucleo.Dopo il distacco, le cellule staminali umane trattate con acido rettinoico hanno formato neuroblasti in coltura in sospensione a seguito della rimozione del FGF basico e, dopo aver permesso ai neuroblasti di aderire a una piastra per colture cellulari, sono apparse estese reti di cellule neuronali portatrici di neuriti e cellule pigmentate, tipiche del SNC, con un drastico aumento dell'efficienza, e sono state coltivate per oltre tre mesi. Queste cellule neuronali derivate da cellule staminali umane esprimevano la tubulina beta tre rispetto alla differenziazione multilineage spontanea di cellule non trattate con acido rettinoico e co-esprimevano la map due una volta acquisita la tecnica. Questa tecnica può essere utilizzata per generare progenitori neuronali in cellule neuronali in modo uniforme da cellule staminali embrionali umane pluripotenti in circa quattro settimane, se eseguita correttamente.Non dimenticare che lavorare con cellule umane può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come assicurarsi che le linee cellulari siano prive di agenti patogeni e micoplasmi, prima di eseguire questa procedura.

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