Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di derivare la progenie neuronale direttamente ed esclusivamente da cellule staminali embrionali umane pluripotenti utilizzando l'induzione di piccole molecole. Ciò si ottiene aggiungendo acido rettino a cellule indifferenziate mantenute in condizioni definite. Successivamente, il processo di differenziazione viene continuato staccando le cellule in una coltura in sospensione dove formano cluster cellulari galleggianti chiamati neuroblasti.

Se i neuroblasti possono attaccarsi a una piastra di coltura tissutale in terreni di neurodifferenziazione, sviluppano le caratteristiche dei neuroni maturi. In definitiva, l'immunofluorescenza e la deconvoluzione o la microscopia confocale possono essere utilizzate per mostrare l'effetto del trattamento con acido rettino nella morfologia e nell'espressione dei marcatori delle cellule staminali embrionali umane trattate. In altre tecniche, solo una piccola frazione di cellule persegue un fenotipo neuronale, mentre il nostro metodo consente un'induzione efficiente e ben controllata di cellule staminali embrionali umane pluripotenti esclusivamente verso un lignaggio neuronale mediante la semplice fornitura di piccole molecole.

Ci sono alcuni passaggi a cui prestare attenzione quando si riparano le soluzioni di serie. Fare attenzione a scongelare lentamente il matrigel e la laminina umana da meno 80 gradi Celsius a quattro gradi Celsius durante la notte, conservare i terreni a quattro gradi Celsius e riscaldare sempre i terreni a 37 gradi Celsius prima dell'uso. Inoltre, quando si preparano terreni ESL umani, alcuni degli integratori vengono aggiunti appena prima di essere utilizzati.

Questi includono BFGF, acido ascorbico, insulina umana attiva in A e transfering. Quindi, preparare il gel matra o le soluzioni di lavoro di laminina umana immediatamente prima del rivestimento della piastra. Incubare le piastre a 37 gradi SIU in anidride carbonica al 5% Dopo aver preparato le piastre di coltura tissutale pre-rivestite di gelatina.

La gelatina può essere sostituita dalla soluzione di lavoro matrigel o laminina. Rivestire queste piastre incubandole per una notte a quattro gradi Celsius. Inizia lasciando crescere le colonie di cellule ES umane per cinque-sette giorni e poi preparati a dividersi.

Alcune di esse Seleziona colonie con più del 75%Sotto le cellule ES umane differenziate, di solito sono leggermente opache con colonie a bordi definiti contenenti cellule ammucchiate. Un'indicazione dell'inizio della differenziazione di solito sembra essere che le colonie bianche contenenti per lo più cellule differenziate di solito sembrano essere chiare. Non selezionare colonie bianche o chiare.

Tieni le piastre verso la luce e usa un pennarello per delineare le colonie leggermente opache sul fondo delle piastre lungo i contorni. Utilizzare il bordo di una punta di pipetta sterile P 2 per staccare lo strato di fibroblasti circostante dalla colonia di cellule ES umane. Quindi rimuovere le cellule dei fibroblasti circostanti e rimuovere anche tutte le parti differenziate della colonia.

Ora aspirare il vecchio terreno contenente le cellule differenziate staccate. Successivamente, in ogni pozzetto, lavare una volta le cellule indifferenziate con terreni cellulari E es umani privi di BFGF, quindi aggiungere tre millilitri di terreno ESL umano fresco contenente B-F-G-F-B-F-G-F immediatamente prima dell'uso. Ora usa una punta di pipetta sterile P 2 per tagliare le colonie in piccoli pezzi e staccarle dalla piastra.

Tirare i pezzi di colonia staccati nel loro terreno in un tubo conico da 50 millilitri. Tirane uno in più. Risciacquo del supporto millilitro per pozzetto.

Le cellule sono ora pronte per un'ulteriore differenziazione utilizzando piccole molecole. Inizia riscaldando i piatti appena ricoperti a 37 gradi Celsius. Aspirare la soluzione di rivestimento dalle piastre e aggiungere un'aliquota di quattro millilitri di terreno contenente pezzi di colonia in ciascun pozzetto, quindi trasferire delicatamente le piastre in un'incubatrice senza agitarle.

Non disturbare i piatti in modo che possano seminare. Dopo la semina per tre giorni, crea nuovi terreni contenenti acido omico. Quindi rimuovere la maggior parte dei vecchi supporti, lasciando quanto basta in modo che le celle rimangano sommerse.

Le celle non dovrebbero mai essere lasciate asciugare a vicenda. Bene: aggiungere quattro millilitri di terreno di coltura ES umano fresco con BFGF e acido rettino. Sostituire il terreno a giorni alterni e lasciare crescere le colonie di cellule ES umane trattate con acido rettino.

Dopo sette o otto giorni, le cellule avranno subito cambiamenti morfologici in grandi cellule differenziate. Quindi procedere con la creazione di una coltura cellulare in sospensione per iniziare una coltura in sospensione staccando le colonie ESL dalle cellule che si sono differenziate e migrate spontaneamente per formare uno strato di fibroblasti. Utilizzare la tecnica di cui sopra con una punta di pipetta sterile, quindi aspirare il vecchio terreno contenente cellule di fibroblasti staccate galleggianti.

Lavare le celle una volta con il terreno HESC e rimetterle in sospensione in tre millilitri di terreno HESC. Ora utilizzando un puntale per pipetta sterile P 2. Tagliate le colonie a pezzetti e staccatele dal piatto.

Estrarre il terreno con le colonie staccate in un unico tubo conico da 50 millilitri. Sciacquare i pozzetti con un millilitro di terreno e aggiungere il risciacquo alla piscina. Quindi aliquotare quattro millilitri di cellule raggruppate in ciascun pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa a sei pozzetti per quattro o cinque giorni, conservare la piastra in un incubatore.

Durante questo periodo, si formeranno cluster cellulari galleggianti o neuroblasti per far avanzare ulteriormente il neuroblasto verso un fenotipo neuronale più maturo. Estrarre il supporto che li contiene in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi centrifugare le celle a 1.400 giri/min per cinque minuti.

Aspirare, pesare il più possibile il vecchio terreno e aggiungere una quantità uguale di terreno NSC fresco contenente VEGF N NT three e BDNF. Mescolare le cellule in una sospensione mediante pipettaggio, quindi aliquotare quattro millilitri di sospensione per pozzetto in sei. Le piastre per la coltura dei tessuti a pozzetti trasferiscono le piastre in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius.

Il neuroblasto si attaccherà alle piastre di coltura durante la notte per una coltura 3D a Matrigel o un laminato umano alla sospensione dei neuroblasti. E una matrice 3D polimerizzerà a 37 gradi Celsius. Sostituire il supporto a giorni alterni.

Entro due settimane, appariranno estese reti di cellule neuronali contenenti neuriti e cellule pigmentate, l'acido rettino è reso sufficiente per indurre le cellule ES umane mantenute nel sistema di coltura definito a passare dalla pluripotenza esclusivamente a un fenotipo neuroepidermico. Dopo l'esposizione di cellule E es umane indifferenziate all'acido retinoico, tutte le cellule all'interno della colonia hanno subito cambiamenti morfologici in grandi cellule differenziate che hanno cessato di esprimere il marcatore associato alla pluripotenza OCT quattro. Le cellule hanno anche iniziato a esprimere vari marcatori associati al neuroectoderma come HNK uno a, P due e TRKC.

Queste grandi cellule differenziate hanno continuato a moltiplicarsi e le colonie sono aumentate di dimensioni, esprimendo spontaneamente il marcatore neuronale precoce beta tre tubulina. La mappa del marcatore neuronale più maturo due ha iniziato ad apparire nelle aree delle colonie in cui le cellule si erano accumulate. Per coincidenza, con la comparsa delle cellule neuroectodermiche, il fattore di trascrizione neuronale specifico NER one è implicato nella differenziazione neuronale dopaminergica e nell'attivazione del gene della tirosina idrossilasi traslocato nel nucleo.

Dopo il distacco, le cellule ES umane trattate con acido rettino hanno formato neuroblasti in una coltura in sospensione dopo la rimozione dell'FGF basico e dopo aver permesso al neuroblasto di attaccarsi a una piastra di coltura tissutale, estese reti di cellule neuronali contenenti neuriti e cellule pigmentate, tipiche del SNC, hanno iniziato a comparire con un drastico aumento dell'efficienza e hanno potuto essere coltivate in tre mesi. Queste cellule neuronali derivate da cellule ES umane esprimevano beta tre tubulina rispetto alla differenziazione spontanea multi-lineage di cellule senza trattamenti con acido rettino e co-espresse map two Once padroneggiata. Questa tecnica può essere utilizzata per generare progenitori neuronali in cellule neuronali in modo uniforme da cellule staminali embrionali umane pluripotenti in circa quattro settimane, se eseguita correttamente.

Non dimenticare che lavorare con le cellule umane può essere estremamente pericoloso e che prima di eseguire questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come assicurarsi che le linee cellulari siano prive di agenti patogeni e micoplasma.