Derivazione efficiente dei diritti dell'uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere derivati cardiaci direttamente ed esclusivamente da cellule staminali embrionali umane pluripotenti mediante induzione con molecole di piccole dimensioni. Questo risultato si ottiene aggiungendo nicotinamide a cellule ES umane indifferenziate mantenute in condizioni definite. Successivamente, le cellule in differenziamento cardiaco vengono staccate per formare cardioblasti, ovvero aggregati cellulari sospesi in una coltura in sospensione.

Una volta formati, i cardio blasti vengono aggiunti a un mezzo di differenziamento cardiaco nel quale proseguono il loro sviluppo fino a diventare cardiomiociti contrattili. Infine, i risultati vengono valutati mediante immunofluorescenza con microscopia a deconvoluzione o confocale e tramite registrazioni elettrofisiologiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un'induzione efficiente delle cellule staminali embrionali umane pluripotenti esclusivamente verso una linea cardiaca, semplicemente fornendo molecole di piccole dimensioni.

Nei metodi esistenti di differenziamento multilinaggio, solo una piccola frazione di cellule assume un fenotipo cardiaco. Vi sono alcuni passaggi da eseguire con attenzione durante la preparazione delle soluzioni madri. Prestare attenzione a scongelare lentamente il matrigel e la laminina umana da meno 80 gradi Celsius a quattro gradi Celsius durante la notte, conservare i mezzi a quattro gradi Celsius e riscaldarli sempre a 37 gradi Celsius prima dell'uso.

Inoltre, durante la preparazione del mezzo per cellule staminali umane E, alcuni integratori vengono aggiunti immediatamente prima dell'uso. Questi includono BFGF, acido ascorbico, insulina umana attiva in A e transferina. Successivamente, preparare le soluzioni operative di matrigel o laminina umana immediatamente prima del rivestimento delle piastre.

Incubare le piastre a 37 gradi SIU in anidride carbonica al 5% dopo aver preparato le piastre per coltura tissutale pre-ricoperte di gelatina. La gelatina può essere sostituita dalla soluzione lavorata di matra gel o da soluzione lavorata di laminina. Ricoprire queste piastre incubandole tutta la notte a quattro gradi Celsius.

Iniziare lasciando crescere le colonie di cellule staminali embrionali umane per cinque a sette giorni, quindi prepararsi a suddividerne alcune. Selezionare colonie con oltre il 75% di cellule staminali embrionali umane non differenziate. Di solito sono leggermente opache, con margini ben definiti e contenenti cellule ammassate. Un'indicazione dell'inizio della differenziazione è solitamente rappresentata da colonie bianche; le colonie contenenti principalmente cellule differenziate appaiono invece trasparenti.

Non selezionare le colonie bianche o trasparenti. Tenere le piastre contro la luce e utilizzare un pennarello per delineare le colonie leggermente opache sul fondo delle piastre lungo i contorni. Utilizzare il bordo di una punta sterile per pipetta P2 per staccare lo strato di fibroblasti circostante dalla colonia di cellule staminali embrionali umane.

Quindi rimuovere le cellule fibroblastiche circostanti e anche tutte le parti differenziate della colonia. Aspirare ora il vecchio terreno contenente le cellule differenziate staccate. Successivamente, in ogni pozzetto lavare le cellule indifferenziate una volta con terreno per cellule staminali embrionali umane privo di BFGF, quindi aggiungere tre millilitri di terreno fresco per cellule staminali embrionali umane contenente B-F-G-F-B-F-G-F, che viene aggiunto al terreno fresco immediatamente prima dell'uso.

Ora utilizzare una punta sterile per pipetta P2 per tagliare le colonie in piccoli pezzi e staccarle dalla piastra. Aspirare i frammenti di colonia staccati insieme al loro mezzo in un tubo conico da 50 millilitri. Aspirare un risciacquo aggiuntivo di un millilitro di mezzo per ogni pozzetto.

Le cellule sono ora pronte per ulteriori differenziazioni mediante l'uso di molecole di piccole dimensioni. Riscaldare innanzitutto le piastre appena rivestite a 37 gradi Celsius. Aspirare la soluzione di rivestimento dalle piastre e aggiungere un'aliquote di quattro millilitri di mezzo contenente frammenti di colonie in ciascun pozzetto, quindi trasferire delicatamente le piastre nell'incubatore senza agitarle.

Non disturbare le piastre per consentire l'adesione delle cellule. Successivamente, rimuovere la maggior parte del vecchio mezzo, lasciandone una quantità sufficiente a mantenere le cellule immerse. Le cellule non devono mai essere lasciate asciugare.

Mescolare il mezzo ESL umano fresco contenente FGF di base e nicotinamide e aggiungere il volume calcolato in millilitri di questo mezzo in ciascun pozzetto. Il mezzo può essere conservato fino a due settimane a quattro gradi Celsius, periodo durante il quale può essere utilizzato per rinnovare la coltura cellulare ogni due giorni al fine di favorire la crescita delle colonie. Dopo otto-dieci giorni, le cellule avranno subìto cambiamenti morfologici, trasformandosi in grandi cellule differenziate che si sono moltiplicate e accumulate.

Proseguire quindi con una coltura in sospensione: per iniziare la coltura in sospensione, staccare le colonie ESL dalle cellule che si sono differenziate spontaneamente e migrate formando uno strato di fibroblasti. Utilizzare la tecnica sopra descritta con una punta sterile di pipetta, quindi aspirare il vecchio mezzo contenente le cellule di fibroblasti staccate in sospensione. Lavare le cellule una volta con mezzo HESC e risospendere in tre millilitri di mezzo HESC utilizzando ora una punta sterile per pipetta P2.

Tagliare le colonie in piccoli pezzi e staccarle dalla piastra. Aspirare il mezzo contenente le colonie staccate in un singolo tubo conico da 50 millilitri. Risciacquare le pozzette con un millilitro di mezzo e aggiungere il risciacquo al pool.

Quindi aliquotare quattro millilitri delle cellule raggruppate in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti con superficie ultra-bassa di adesione per quattro-cinque giorni. Mantenere la piastra in un incubatore per consentire la formazione di aggregati cellulari sospesi o cardio-blasti, favorendo il passaggio al fenotipo di cardiomiociti contrattili. Raccoglierli in un tubo conico da 50 millilitri insieme al loro mezzo di coltura.

Quindi centrifugare le cellule a 1.400 giri al minuto per cinque minuti. Aspirare, pesare la maggior quantità possibile del vecchio mezzo e aggiungere una quantità uguale di mezzo fresco per la differenziazione cardiaca contenente nicotinamide 10 millimolare.

Mescolare i blasti cardiaci in sospensione con una pipetta, quindi aliquotare quattro millilitri della sospensione di blasti cardiaci in ogni pozzetto di piastre per colture cellulari a sei pozzetti. Trasferire le piastre in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per consentire ai blasti cardiaci di aderire alle piastre per colture cellulari durante la notte. Ogni due giorni in coltura.

Sostituire il mezzo di differenziamento cardiaco contenente 10 mini molin di nicotinamide al giorno otto. Passare al differenziamento cardiaco. Continuare a sostituire il mezzo senza nicotinamide ogni due giorni.

Entro due settimane dal ritiro della nicotinamide, inizieranno ad apparire cardiomiociti contrattili il cui numero aumenterà progressivamente; la nicotinamide si è dimostrata sufficiente per indurre cellule staminali embrionali umane mantenute in un sistema di coltura definito a passare dalla pluripotenza esclusivamente a un fenotipo cardio-mesodermico. Dopo l'esposizione di cellule staminali embrionali umane indifferenziate alla nicotinamide, tutte le cellule all'interno della colonia hanno subito cambiamenti morfologici, trasformandosi in grandi cellule differenziate che riducono l'espressione di OCT4. Le cellule hanno inoltre iniziato ad esprimere il fattore di trascrizione specifico per il muscolo cardiaco NKX2.5 e ad esprimere anche l'alfa-actinina.

Entrambe le caratteristiche sono coerenti con il fenotipo del mesoderma cardiaco. Queste cellule differenziate continuano a moltiplicarsi e ad aumentare di dimensione nelle aree delle colonie in cui le cellule si sono accumulate. L'espressione di NKX 2.5 è diventata più intensa Dopo il distacco, le cellule staminali umane trattate con nicotinamide hanno formato cardio blasti in una coltura in sospensione.

Dopo aver lasciato attaccare i blasti cardiovascolari, questi sono stati trattati con nicotinamide per una settimana; da una a due settimane dopo la sospensione della nicotinamide, sono iniziati ad apparire cardiomiociti contrattili con un aumento drastico dell'efficienza. Questi si presentavano come aggregati cellulari che pulsavano con contrazioni ritmiche; la differenziazione spontanea multipotente di cellule non sottoposte al trattamento IDE non ha espresso tali caratteristiche. Le cellule all'interno degli aggregati di cardiomiociti contrattili esprimevano marcatori tipici dei cardiomiociti, tra cui NK X 2.5 e alfa-actinina.

Le contrazioni dei cardiomiociti battenti sono state confermate, mediante profili elettrici, essere forti, ritmiche e al contempo coordinate e ben sincronizzate; hanno mostrato impulsi regolari simili ai complessi P-Q-R-S-T, osservati negli elettrodi applicati sulla superficie corporea negli elettrocardiogrammi clinici. Inoltre, i cardiomiociti sono in grado di mantenere una marcata contrattilità per oltre tre mesi una volta acquisita la tecnica. Questa tecnica può essere utilizzata per generare in modo uniforme precursori cardiaci e cardiomiociti battenti da cellule staminali embrionali umane pluripotenti in circa cinque settimane, se eseguita correttamente.