Name: Derivazione efficiente dei diritti delluomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Scopri come derivare progenitori cardiaci e cardiomiociti funzionali da cellule staminali embrionali umane mediante induzione con piccole molecole come la nicotinamide. Questo protocollo semplifica la differenziazione e aumenta la resa per applicazioni terapeutiche cardiovascolari.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

XHP è stato sostenuto dal National Institute of Health (NIH) sovvenzioni da National Institute on Aging (NIHK01AG024496) e The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano (NIHR21HD056530).

1. Soluzione e Media Preparazione <ol><li> Rivestimento in gelatina soluzione: 0,1% (w / v) gelatina in DDH 2 O, autoclave e conservare a 4 ° C. </li><li> Matrigel rivestimento soluzioni. Soluzione: lento disgelo Matrigel (10 ml) a 4 ° C per una notte, aggiungere 10 ml ghiacciata DMEM o DMEM/F12, mescolare bene e aliquota 1 ml / tubo sotto cappuccio tessuto sterilizzato cultura, conservare a -20 ° C. Soluzione di lavoro: lento disgelo 1 ml aliquota Matrigel a 4 ° C per 1-2 ore, il trasferimento di 14 ml o refrigerata DMEM DMEM/F12 e mescolare bene sotto cappa sterile cultura del tessuto immediatamente prima del rivestimento. </li><li> Umano laminina soluzione di rivestimento: diluire 1 ml di soluzione umana laminina (0,5 mg / ml in Tris tamponata NaCl, conservare a -80 ° C, lento disgelo a 4 ° C per 1-2 ore) con ghiaccio freddo o DMEM DMEM/F12 a 12,5 ml soluzione di lavoro (40 mcg / ml) sotto cappa sterile cultura del tessuto immediatamente prima del rivestimento. </li><li> Fattore di crescita soluzioni madri (500-1000X): sciogliere il fattore di crescita a 10 mcg/ Ml in tampone sterile (0,5% di BSA, 1,0 mM DTT, 10% glicerolo, 1XPBS) e di memorizzare fino a 50-100 microlitri / tubo aliquote a -80 ° C. </li><li> Mezzi di comunicazione HESC: DMEM/F12 o KO-DMEM (80%), KO sostituzione del siero (20%), L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm), MEM acidi aminoacidi non essenziali (MNAA, 1X), e β-mercaptoetanolo (100 micron), filtrare e conservare a 4 ° C, integrato con 20 ng / ml bFGF prima dell'uso. O la sostituzione di "KO sostituzione siero" con componenti definiti: DMEM/F12 o KO-DMEM (100%), L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm), MNAA (1X), MEM aminoacidi essenziali (MEAA , 1X) e β-mercaptoetanolo (100 micron), filtrare e conservare a 4 ° C, integrato con bFGF (20 ng / ml), l'insulina umana (20 mg / ml), acido ascorbico (50 mg / ml), umano activina A (50 ng / ml), albumina umana / Albumax (10 mg / ml), e transferrina umana (8 mcg / ml) prima dell'uso. </li><li> Mezzi di differenziazione cardiaca HESC: DMEM/F12 (90%), FBS definita (10%), e L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm). </li><li> Supporti contenenti nicotinamide (NAM): aggiungere NAM ai media HESC o supporti differenziazione HESC cardiaco a una concentrazione finale di 10 mm, filtrato, conservare a 4 ° C ed utilizzare entro 2 settimane di preparazione. </li></ol> 2. Lastra di rivestimento <ol><li> Piastre cappotto con gelatina: aggiungere 2,5 ml / pozzetto di soluzione di gelatina a 6 piastre ed incubare una notte a 37 ° C incubatore umidificato. </li><li> Piastre cappotto con laminina: chill gelatina rivestite piatti e rimuovere la gelatina, aggiungere 2,5 ml / o umani e Matrigel soluzione di rivestimento laminina lavoro di pre-refrigerata gelatinizzato 6 pozzetti ed incubare a 4 ° C durante la notte. </li></ol> 3. Passaging e semina hESC indifferenziato in condizioni definite <ol><li> Lasciare colonie hESC crescere fino a 5-7 giorni vecchi, e prendere la cultura piastra hESC a microscopio da dissezione (pre-riscaldare dissezione fase a 37 ° C) sotto cappa sterile dissezione. </li><li> Seleziona colonie hESC da dividere. Morfologicamente, queste colonie avrebbero dovuto&gt; 75% hESC indifferenziato (smtutte le cellule compatte), di solito leggermente opaco (non bianco-ammucchiati cellule non differenziate cellule chiare) con bordo definito sotto il microscopio da dissezione. Attentamente delineare le colonie selezionate e rimuovere strato differenziato dei fibroblasti che circonda la colonia e tutte le parti differenziate (se presente) della colonia con il bordo della P2 punta pipetta sterile o tirato capillare di vetro. </li><li> Rimuovere i vecchi media mobile contenente le cellule differenziate staccato da aspirazione. Lavare con i media hESC (senza bFGF) una volta. Aggiungere 3 ml / media hESC ben fresco contenente 20 ng / ml bFGF. </li><li> Tagliare le colonie hESC indifferenziato in piccoli pezzi, e staccare con la punta della pipetta sterile o vetro tirato capillare. </li><li> Piscina i supporti contenenti pezzi staccati colonia insieme in un tubo da 50 ml. Lavare la piastra una volta con 1 ml / media hESC pozzetto contenente 20 ng / ml bFGF e piscina insieme. </li><li> Aspirare il Matrigel o umano soluzione laminina dalle piastre rivestito fresca. Aliquota 4 ml / h beneCES supporti contenenti pezzi colonia di un 6-pozzetti. Delicatamente trasferire la piastra per incubatore senza agitare e lasciare colonia semi di pezzi durante la notte senza disturbare umidificata in un incubatore a 37 ° C con una atmosfera di 5% di CO 2. </li></ol> 4. Induzione cardiaco di hESC in Sistema Cultura definita con Nicotinamide <ol><li> Al 3 ° giorno dopo la semina, rimuovere la maggior parte dei vecchi media da ciascun pozzetto della piastra e di lasciare i supporti a sufficienza per permettere colonie hESC di essere sommersa (mai permettere hESC ad asciugarsi). Sostituire con 4 ml / media hESC ben fresco contenente 20 ng / ml bFGF e 10 mM nicotinamide (NAM). </li><li> Sostituire vecchi media con i media hESC fresca contenente 20 ng / ml bFGF e 10 mm NAM a giorni alterni, e permettere cardiaca indotta colonie hESC crescere a 8-10 giorni. Su esponendo a NAM, tutte le cellule all'interno della colonia subirà cambiamenti morfologia a grandi cellule differenziate che continueranno a moltiplicarsi. Le colonie aumentano di dimensione, e di 8-10 giorni, und cellule cominceranno ad accumularsi in alcune aree delle colonie. </li></ol> 5. Continuando differenziazione cardiaca in Cultura Sospensione <ol><li> Prendere la cultura piastra hESC microscopio a dissezione (pre-riscaldare dissezione fase a 37 ° C) sotto cappa sterile dissezione. Attentamente delineare le colonie e rimuovere strato di fibroblasti che circonda la colonia (cellule differenziate migrate dalla colonia) con il bordo della P2 puntale sterile o tirato capillare di vetro. </li><li> Rimuovere i vecchi media mobile contenente cellule di fibroblasti staccato da aspirazione. Lavare con i media hESC (senza bFGF) una volta. Aggiungere 3 ml / media hESC ben fresco (senza bFGF). </li><li> Tagliare il cardiaca indotta colonie hESC in piccoli pezzi, e staccare con la punta della pipetta sterile o vetro tirato capillare. </li><li> Piscina i supporti contenenti pezzi staccati colonia insieme in un tubo da 50 ml. Lavare la piastra una volta con 1 ml / media hESC bene (senza bFGF) e piscina insieme. </li><li> Aliquota 4 ml / pozzetto senza siero hESC supporti contenenti pezzi colonia di un 6-pozzetti bassissimo attaccamento e incubare a 37 ° C umidificata incubatore per consentire galleggiante ammassi cellulari (cardioblasts) per formare per 4-5 giorni. </li></ol> 6. Battere Maturazione Cardiomyocyte fenotipo in Cultura adesivo <ol><li> Piscina i supporti contenenti cardioblasts galleggiante insieme in un tubo da 50 ml. Centrifugare a 1400 rpm per 5 min. Aspirare il vecchi media per quanto è possibile e aggiungere pari quantità di mezzi freschi differenziazione hESC cardiaco contenente 10 mM NAM. </li><li> Pipetta su e giù per miscelare cardioblasts galleggianti e aliquota 4 ml / pozzetto a 6-pozzetti. Trasferire le piastre a 37 ° C in incubatore umidificato per consentire cardioblasts di allegare tutta la notte. </li><li> Sostituire i media differenziazione cardiaca hESC contenente 10 mM NAM a giorni alterni. </li><li> Al giorno 8, sostituire con i media differenziazione hESC cardiaco senza NAM, e continuano a sostituire HESC cardiaca media e differenziazionegiornata molto altro. Cardiomiociti battendo cominceranno a comparire in circa 1-2 settimane di coltivazione continua dopo la sospensione del NAM e aumentare di numero col tempo, e avrebbe potuto mantenere forti contrazioni ritmiche e per oltre 3 mesi. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Nicotinamide (NAM) è reso sufficiente a indurre hESC mantenuto nel sistema cultura definita la transizione da pluripotenza esclusivamente ad un fenotipo cardiomesodermal (Fig. 2B). In caso di esposizione di hESC indifferenziato a NAM, tutte le cellule all'interno della colonia subirà cambiamenti morfologia a grandi cellule differenziate che down-regolano l'espressione di Oct-4 e cominciare a esprimere il fattore di trascrizione cardiaci specifici (CSX) Nkx2.5 e α- actinina, in linea con un fenotipo cardiomesoderm (Fig. 2B). Queste cellule differenziate continueranno a moltiplicarsi e le colonie aumentano di dimensione. Aumentata intensità di Nkx2.5 saràsi osservano di solito nelle aree delle colonie in cui le cellule iniziano ad accumularsi (Fig. 2B). Dopo aver staccato la hESC NAM trattati formeranno galleggiante ammassi cellulari (cardioblasts) in una cultura sospensione per continuare il processo di differenziazione cardiaca. Dopo permettendo cardioblasts di allegare e di continuare a trattare con NAM per 1 settimana, battendo cardiomiociti cominceranno a comparire in circa 1-2 settimane di coltivazione continua dopo la sospensione del NAM con un drastico aumento di efficienza rispetto ai spontanea multi-lignaggio differenziazione delle hESC senza trattamento nel periodo di tempo stesso (Fig. 2C). Cellule all'interno dei cluster battendo cardiomiociti esprimerà marcatori caratteristici dei cardiomiociti, tra cui Nkx2.5 e α-actinina (Fig. 2C). Le contrazioni dei cardiomiociti battere sono stati confermati da profili elettrici di essere forte, ritmico, ben coordinato, e ben trascinato, con impulsi regolari che ricorda il p-QRS-T-complessi visto da elettrodi di superficie corporea in elettrocardiogrammi clinica (Fig. 2C, vedi anche il video). I cardiomiociti potrebbero mantenere il loro contrattilità forte per oltre 3 mesi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Schemi complessiva di approccio convenzionale rispetto a piccole molecole-induzione approccio per la differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti verso cellule specializzate funzionale. (A) Uno schema di approccio convenzionale con multi-lineage inclinazione di cellule staminali umane pluripotenti attraverso la differenziazione spontanea foglietto embrionale. (B) Uno schema di ben controllata induzione efficiente delle cellule staminali umane pluripotenti esclusivamente ad una particolare stirpe clinicamente rilevanti da semplice disposizione di piccole molecole. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Nicotinamide induce specifiche cardiaco discendenza diretta di pluripotenza in determinate condizioni e la progressione verso battendo cardiomiociti. (A) Schema raffigurante la linea temporale del protocollo di regia differenziazione cardiaca di hESC. (B) Dopo l'esposizione di hESC indifferenziato di Nicotinamide (NAM) nell'ambito del sistema cultura definita, grande differenziati ottobre-4 (rosso), le cellule negative all'interno della colonia ha cominciato ad emergere, rispetto ai mock-trattati (DMSO) hESC come il controllo. NAM-indotta delle cellule ottobre-4-negativi cominciarono a esprimere Nkx2.5 (verde) e α-actinina (rosso), in linea con primi differenziazione cardiaca. Intensità progressivamente aumentato di Nkx2.5 era di solito osservata nelle aree della colonia in cui cellule hanno cominciato ad accumularsi. Tutte le cellule sono indicati da colorazione DAPI dei loro nuclei (blu). (C) NAM-indotta cardiaco impegnati hESC prodotto cardiomiociti battendo con un drastico aumento dell'efficienza, come valutato dal cellulare clusparametri che visualizzate contrazioni ritmiche (guarda il profilo elettrofisiologiche e il video), e immunopositive per Nkx2.5 (verde) e α-actinina (rosso). Immagini fase di cluster di grandi dimensioni rappresentante battendo cardiomiociti e le immagini di potenza superiore del rappresentante contrazione dei muscoli cardiaci sono indicati (vedi anche il video corrispondente). Le frecce indicano il grande grappolo cardiomiociti battendo utilizzato per la registrazione elettrofisiologica. Profilo elettrofisiologica del cardiomiociti battere spettacoli regolari, trascinato, impulsi ritmici ricorda il p-QRS-T-complessi visto in elettrocardiogrammi clinica. Barre di scala: 0,1 mm. Video: Amministrazione cardiomiociti differenziati da NAM-indotta hESC. Video 1 e 2 video rappresentativi mostrano grande battendo cluster cardiomiociti in circa 1 e 3 mesi dopo l'attacco. Video 3 e 4 mostrano rappresentante contrazione dei muscoli cardiaci a più alto potere. 5 mostra una typical piccolo gruppo cardiomiociti battere spontaneamente differenziata da hESC senza trattamento NAM come controllo. <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">Clicca qui per vedere video 1.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">Clicca qui per vedere Video 2.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">Clicca qui per vedere video 3.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">Clicca qui per vedere 4 Video.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">Clicca qui per vedere video 5.</a>

<ol><li>Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+tissue+engineering%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue.+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Myocardial tissue engineering: a review.</a> J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).</li>
<li>Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453, 322-329 (2008).</li>
<li>Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+and+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Rev%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells and cardiac repair.</a> Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).</li>
<li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+precautions+when+deriving+patient-specific+neural+elements+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells.</a> Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).</li>
<li>J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. , 282-1145 (1998).</li>
<li>Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).</li>
<li>Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).</li>
<li>Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+reprogrammed+fibroblasts+functionally+integrate+into+the+fetal+brain+and+improve+symptoms+of+rats+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).</li>
<li>Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li>
<li>Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nature Methods. 2, 185-190 (2005).</li>
<li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patents+on+technologies+of+human+tissue+and+organ+regeneration+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Patents+on+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells.</a> Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).</li>
<li>Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromechanical+integration+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).</li>
<li>Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O'Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infracted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).</li>
<li>Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+improves+myocardial+performance+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).</li>
<li>Akazawa, H., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+transcription+factor+Csx%2FNkx2-5%3A+Its+role+in+cardiac+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases.</a> Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).</li>
<li>Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142, 375-386 (2010).</li>
<li>Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+a+direct+reprogramming+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy.</a> Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).</li>
<li>Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467, 285-290 (2010).</li>
<li>Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+coding+mutations+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li>
<li>Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastic+derivatives+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+exhibit+limited+expansion+and+early+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence.</a> Stem Cells. 28, 704-712 (2010).</li>
<li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano interessi in competizione. XHP è il fondatore di Xcelthera. XHP e EYS hanno proprietà intellettuale relativi alle hESC.

Una delle sfide più importanti sia per lo studio dello sviluppo e la traduzione clinica è stata come incanalare le ampie potenzialità di differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti da un fenotipo desiderato in modo efficiente e prevedibile. Anche se tali cellule possono differenziarsi spontaneamente in vitro in cellule di tutti gli strati germinali passando attraverso un multi-lignaggio fase aggregata, in hESC derivati ​​multi-lignaggio aggregati (corpi embrionali), solo una piccola frazione di cellule (&lt;2%) spontaneamente differenziarsi in cardiomiociti 13-15 (Fig. 1A). Immunoselection seguito, le popolazioni arricchite di cardiomiociti stati in grado di fungere da pacemaker biologico per salvare la funzione di un miocardio danneggiato meccanicamente ed elettronicamente dopo l&#39;iniezione nel cuore di modelli animali 13. In modelli di roditori infartuata, radicato hESC derivati ​​progenie cardiaco sono stati in grado di sopravvivere e maturare fino a 12 settimane, e parzialmente remuscularizzare il cuore ferito e migliorare la funzione contrattile 14,15. Tuttavia, l&#39;inefficienza nella generazione di umani impegnati cellule cardiache attraverso multi-lignaggio differenziazione delle cellule pluripotenti e l&#39;alto rischio di cancerogenicità a seguito di trapianto hanno impedito ulteriori traduzioni cliniche. Sviluppare strategie per incanalare l&#39;ampio potenziale di differenziazione hESC pluripotenti esclusivamente e prevedibile di un fenotipo cardiaco è fondamentale per sfruttare la potenza di biologia hESC in campo cuore. Per raggiungere in modo uniforme la conversione di cellule staminali umane pluripotenti da una stirpe particolare, abbiamo impiegato un sistema di coltura definito in grado di assicurare la proliferazione di hESC indifferenziato per identificare le condizioni per ben controllata induzione efficiente delle hESC pluripotenti esclusivamente ad una particolare stirpe clinicamente rilevanti dalla semplice fornitura di piccole molecole (Fig. 1B). Abbiamo scoperto che nicotinamide indotto cardio-lignaggio impegno diretto da phESC luripotent sotto cultura definita che ulteriormente progredita per battere cardiomiociti ad alta efficienza (Fig. 2). Nkx2.5 è evolutivamente conservata fattore di trascrizione homeobox indispensabile per il normale sviluppo cardiaca e le mutazioni del gene sono associate a malattie cardiache congenite umane (CHD), il difetto più comune nascita umana 16. Espressione di Nkx2.5 è il primo marcatore di cellule precursori cuore in tutti i vertebrati finora esaminato ed è essenziale per una corretta septation cardiaco e la formazione / maturazione del sistema di conduzione elettrico 16. Nei vertebrati, l&#39;inizio e il modello di inizio Nkx2.5 espressione o meno coincidere con i tempi e l&#39;area di specifica cardiache in embriogenesi precoce e Nkx2.5 gene continua ad essere espressa attraverso lo sviluppo nel cuore 16. Nel nostro modello hESC, NAM è apparso per attivare l&#39;induzione cardiaco diretto da hESC pluripotenti, promuovendo l&#39;espressione di cardio-specifica transcriPZIONE Nkx2.5 fattore in un processo che potrebbe emulare le specifiche del cardiomesoderm dal epiblast pluripotenti umane in cardiogenesis embrionale. Studi futuri rivelerà molecole controllo genetico ed epigenetico dello sviluppo cuore umano come alternative, che possono aprire la strada a piccole molecole-mediata controllo diretto e la modulazione del destino hESC quando pluripotenti derivanti lignaggi clinicamente rilevanti per terapie rigenerative. Senza trattamento NAM, hESC &lt;2% sarà oggetto di differenziazione spontanea in cardiomiociti battendo 12-15. Con il trattamento NAM, siamo stati in grado di generare&gt; 95% precursori embrionale cardiomiociti battito cardiaco e&gt; 50% da hESC mantenuto nell&#39;ambito di una definizione di cultura in un processo che potrebbe emulare sviluppo embrionale umano cuore 12. Recentemente, noto cardio-destino geni determinanti sono stati utilizzati per transdifferenziarsi fibroblasti di topo in cardiomiociti battendo post-natale, con una bassa efficienza di &lt;0,5% 17, 18 &lt;/ Sup&gt;. Tuttavia, riprogrammato le cellule somatiche sono state storicamente associato con l&#39;espressione genica anormale e senescenza accelerata con compromissione della utilità terapeutica 19-21. Infine, il protocollo abbiamo stabilito qui è limitato alle hESC pluripotenti derivate dalla massa cellulare interna (ICM) o epiblast della blastocisti umana 4,5, possono non applicare alle cellule pluripotenti altri, tra cui origine animale-CES, CES derivato da morula precedente (otto cellule)-stadio embrioni 22, e le cellule riprogrammate artificialmente 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> Bioscienze BD </td><td> 356231 </td><td> Fattore di crescita ridotta </td></tr><tr><td> Umano laminina </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> Nicotinamide </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out sostituzione siero </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM soluzione di aminoacidi non essenziali (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM soluzione di aminoacidi (MEAA, 100X) </td&gt; <td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Acido ascorbico </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Transferrina umana </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> BFGF umano </td><td> Peprotech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;insulina umana </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Un umano activina </td><td> Peprotech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> FBS definito </td><td> Hyclone </td><td> SH30073-03 </td><td></td></tr><tr><td> 6-ben ultrabassa piastra di fissaggio </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6 pozzetti </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Fino ad oggi, la mancanza di una adeguata fonte di cellule cardiache umane è stata la battuta d&#39;arresto importante nella rigenerazione del miocardio umano, sia a base di cellule staminali ematopoietiche o da 1-3 ingegneria dei tessuti cardiaci. Cardiomiociti diventano terminali differenziati subito dopo la nascita e perdono la loro capacità di proliferare. Non ci sono prove che cellule staminali / progenitrici derivate da altre fonti, come il midollo osseo o il sangue del cordone ombelicale sono in grado di dare origine alle cellule contrattili del muscolo cardiaco in seguito al trapianto nel cuore 1-3. La necessità di rigenerare o riparare il muscolo cardiaco danneggiato non è stato raggiunto con la terapia con cellule staminali adulte, sia endogena o tramite la consegna delle cellule 1-3. Le cellule umane geneticamente stabili staminali embrionali (hESC) hanno la capacità di espansione illimitata e plasticità illimitata, porge un serbatoio pluripotenti per la derivazione in vitro di grandi quantità di cellule somatiche umane che sono limitate al lignaggio nel bisognodi riparazione e rigenerazione 4,5. A causa della prevalenza delle malattie cardiovascolari in tutto il mondo e acuta mancanza di organi, c&#39;è un interesse intenso hESC terapie a base di sviluppo come un approccio alternativo. Tuttavia, come incanalare il potenziale ampia differenziazione delle hESC pluripotenti in modo efficiente e prevedibile di un fenotipo desiderato è stato una grande sfida sia per lo studio e la traduzione di sviluppo clinico. Approcci convenzionali si basano su multi-lignaggio inclinazione di cellule pluripotenti attraverso la differenziazione spontanea foglietto embrionale, con conseguente inefficienza e incontrollabile lignaggio impegno che viene spesso seguita da eterogeneità fenotipica e instabilità, di conseguenza, un elevato rischio di cancerogenicità 6-8 (vedere uno schema a fig. 1A). Inoltre, non definito integratori stranieri / animale biologica e / o alimentatori che sono stati generalmente utilizzati per l&#39;isolamento, l&#39;espansione e la differenziazione delle hESC può utilizzarli direttamente di tali cellule specialiinnesti di Zed nei pazienti problematici 9-11. Per superare questi ostacoli, abbiamo risolto gli elementi di un sistema di coltura definito necessaria e sufficiente per sostenere la epiblast pluripotence di hESC, che funge da piattaforma per la derivazione de novo di hESC clinicamente adeguata ed efficace regia hESC quali uniformemente verso lignaggi clinicamente rilevanti da piccole molecole 12 (vedere uno schema in figura. 1B). Dopo lo screening di una serie di piccole molecole e fattori di crescita, abbiamo riscontrato che tali condizioni definite reso nicotinamide (NAM) sufficiente a indurre le specifiche del cardiomesoderm diretto da hESC pluripotenti che ulteriormente progredita al cardioblasts cardiomiociti umani che ha generato battendo ad alta efficienza (fig. 2 ). Abbiamo definito le condizioni per l&#39;induzione di cardioblasts diretto da hESC pluripotenti senza un intervento a più fasi embrionali lignaggio corpo, consentendo ben controllati derivazione efficiente di ungrande disponibilità di cellule cardiache per tutta la gamma di stadi di sviluppo per le terapie basate sulle cellule.

Abbiamo stabilito un protocollo per l&#39;induzione della cardioblasts pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di risorse umane progenitori cardiaci e funzionale cardiomiociti per la riparazione cardiovascolare.

Derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

A oggi, la mancanza di una fonte adeguata di cellule cardiache umane ha costituito il principale ostacolo nella rigenerazione del miocardio umano, sia attraverso l'approccio basato su cellule...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere derivati cardiaci direttamente ed esclusivamente da cellule staminali embrionali umane pluripotenti mediante induzione con molecole di piccole dimensioni. Questo risultato si ottiene aggiungendo nicotinamide a cellule ES umane indifferenziate mantenute in condizioni definite. Successivamente, le cellule in differenziamento cardiaco vengono staccate per formare cardioblasti, ovvero aggregati cellulari sospesi in una coltura in sospensione.Una volta formati, i cardio blasti vengono aggiunti a un mezzo di differenziamento cardiaco nel quale proseguono il loro sviluppo fino a diventare cardiomiociti contrattili. Infine, i risultati vengono valutati mediante immunofluorescenza con microscopia a deconvoluzione o confocale e tramite registrazioni elettrofisiologiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un'induzione efficiente delle cellule staminali embrionali umane pluripotenti esclusivamente verso una linea cardiaca, semplicemente fornendo molecole di piccole dimensioni.Nei metodi esistenti di differenziamento multilinaggio, solo una piccola frazione di cellule assume un fenotipo cardiaco. Vi sono alcuni passaggi da eseguire con attenzione durante la preparazione delle soluzioni madri. Prestare attenzione a scongelare lentamente il matrigel e la laminina umana da meno 80 gradi Celsius a quattro gradi Celsius durante la notte, conservare i mezzi a quattro gradi Celsius e riscaldarli sempre a 37 gradi Celsius prima dell'uso.Inoltre, durante la preparazione del mezzo per cellule staminali umane E, alcuni integratori vengono aggiunti immediatamente prima dell'uso. Questi includono BFGF, acido ascorbico, insulina umana attiva in A e transferina. Successivamente, preparare le soluzioni operative di matrigel o laminina umana immediatamente prima del rivestimento delle piastre.Incubare le piastre a 37 gradi SIU in anidride carbonica al 5% dopo aver preparato le piastre per coltura tissutale pre-ricoperte di gelatina. La gelatina può essere sostituita dalla soluzione lavorata di matra gel o da soluzione lavorata di laminina. Ricoprire queste piastre incubandole tutta la notte a quattro gradi Celsius.Iniziare lasciando crescere le colonie di cellule staminali embrionali umane per cinque a sette giorni, quindi prepararsi a suddividerne alcune. Selezionare colonie con oltre il 75% di cellule staminali embrionali umane non differenziate. Di solito sono leggermente opache, con margini ben definiti e contenenti cellule ammassate. Un'indicazione dell'inizio della differenziazione è solitamente rappresentata da colonie bianche; le colonie contenenti principalmente cellule differenziate appaiono invece trasparenti.Non selezionare le colonie bianche o trasparenti. Tenere le piastre contro la luce e utilizzare un pennarello per delineare le colonie leggermente opache sul fondo delle piastre lungo i contorni. Utilizzare il bordo di una punta sterile per pipetta P2 per staccare lo strato di fibroblasti circostante dalla colonia di cellule staminali embrionali umane.Quindi rimuovere le cellule fibroblastiche circostanti e anche tutte le parti differenziate della colonia. Aspirare ora il vecchio terreno contenente le cellule differenziate staccate. Successivamente, in ogni pozzetto lavare le cellule indifferenziate una volta con terreno per cellule staminali embrionali umane privo di BFGF, quindi aggiungere tre millilitri di terreno fresco per cellule staminali embrionali umane contenente B-F-G-F-B-F-G-F, che viene aggiunto al terreno fresco immediatamente prima dell'uso.Ora utilizzare una punta sterile per pipetta P2 per tagliare le colonie in piccoli pezzi e staccarle dalla piastra. Aspirare i frammenti di colonia staccati insieme al loro mezzo in un tubo conico da 50 millilitri. Aspirare un risciacquo aggiuntivo di un millilitro di mezzo per ogni pozzetto.Le cellule sono ora pronte per ulteriori differenziazioni mediante l'uso di molecole di piccole dimensioni. Riscaldare innanzitutto le piastre appena rivestite a 37 gradi Celsius. Aspirare la soluzione di rivestimento dalle piastre e aggiungere un'aliquote di quattro millilitri di mezzo contenente frammenti di colonie in ciascun pozzetto, quindi trasferire delicatamente le piastre nell'incubatore senza agitarle.Non disturbare le piastre per consentire l'adesione delle cellule. Successivamente, rimuovere la maggior parte del vecchio mezzo, lasciandone una quantità sufficiente a mantenere le cellule immerse. Le cellule non devono mai essere lasciate asciugare.Mescolare il mezzo ESL umano fresco contenente FGF di base e nicotinamide e aggiungere il volume calcolato in millilitri di questo mezzo in ciascun pozzetto. Il mezzo può essere conservato fino a due settimane a quattro gradi Celsius, periodo durante il quale può essere utilizzato per rinnovare la coltura cellulare ogni due giorni al fine di favorire la crescita delle colonie. Dopo otto-dieci giorni, le cellule avranno subìto cambiamenti morfologici, trasformandosi in grandi cellule differenziate che si sono moltiplicate e accumulate.Proseguire quindi con una coltura in sospensione: per iniziare la coltura in sospensione, staccare le colonie ESL dalle cellule che si sono differenziate spontaneamente e migrate formando uno strato di fibroblasti. Utilizzare la tecnica sopra descritta con una punta sterile di pipetta, quindi aspirare il vecchio mezzo contenente le cellule di fibroblasti staccate in sospensione. Lavare le cellule una volta con mezzo HESC e risospendere in tre millilitri di mezzo HESC utilizzando ora una punta sterile per pipetta P2.Tagliare le colonie in piccoli pezzi e staccarle dalla piastra. Aspirare il mezzo contenente le colonie staccate in un singolo tubo conico da 50 millilitri. Risciacquare le pozzette con un millilitro di mezzo e aggiungere il risciacquo al pool.Quindi aliquotare quattro millilitri delle cellule raggruppate in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti con superficie ultra-bassa di adesione per quattro-cinque giorni. Mantenere la piastra in un incubatore per consentire la formazione di aggregati cellulari sospesi o cardio-blasti, favorendo il passaggio al fenotipo di cardiomiociti contrattili. Raccoglierli in un tubo conico da 50 millilitri insieme al loro mezzo di coltura.Quindi centrifugare le cellule a 1.400 giri al minuto per cinque minuti. Aspirare, pesare la maggior quantità possibile del vecchio mezzo e aggiungere una quantità uguale di mezzo fresco per la differenziazione cardiaca contenente nicotinamide 10 millimolare.Mescolare i blasti cardiaci in sospensione con una pipetta, quindi aliquotare quattro millilitri della sospensione di blasti cardiaci in ogni pozzetto di piastre per colture cellulari a sei pozzetti. Trasferire le piastre in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per consentire ai blasti cardiaci di aderire alle piastre per colture cellulari durante la notte. Ogni due giorni in coltura.Sostituire il mezzo di differenziamento cardiaco contenente 10 mini molin di nicotinamide al giorno otto. Passare al differenziamento cardiaco. Continuare a sostituire il mezzo senza nicotinamide ogni due giorni.Entro due settimane dal ritiro della nicotinamide, inizieranno ad apparire cardiomiociti contrattili il cui numero aumenterà progressivamente; la nicotinamide si è dimostrata sufficiente per indurre cellule staminali embrionali umane mantenute in un sistema di coltura definito a passare dalla pluripotenza esclusivamente a un fenotipo cardio-mesodermico. Dopo l'esposizione di cellule staminali embrionali umane indifferenziate alla nicotinamide, tutte le cellule all'interno della colonia hanno subito cambiamenti morfologici, trasformandosi in grandi cellule differenziate che riducono l'espressione di OCT4. Le cellule hanno inoltre iniziato ad esprimere il fattore di trascrizione specifico per il muscolo cardiaco NKX2.5 e ad esprimere anche l'alfa-actinina.Entrambe le caratteristiche sono coerenti con il fenotipo del mesoderma cardiaco. Queste cellule differenziate continuano a moltiplicarsi e ad aumentare di dimensione nelle aree delle colonie in cui le cellule si sono accumulate. L'espressione di NKX 2.5 è diventata più intensa Dopo il distacco, le cellule staminali umane trattate con nicotinamide hanno formato cardio blasti in una coltura in sospensione.Dopo aver lasciato attaccare i blasti cardiovascolari, questi sono stati trattati con nicotinamide per una settimana; da una a due settimane dopo la sospensione della nicotinamide, sono iniziati ad apparire cardiomiociti contrattili con un aumento drastico dell'efficienza. Questi si presentavano come aggregati cellulari che pulsavano con contrazioni ritmiche; la differenziazione spontanea multipotente di cellule non sottoposte al trattamento IDE non ha espresso tali caratteristiche. Le cellule all'interno degli aggregati di cardiomiociti contrattili esprimevano marcatori tipici dei cardiomiociti, tra cui NK X 2.5 e alfa-actinina.Le contrazioni dei cardiomiociti battenti sono state confermate, mediante profili elettrici, essere forti, ritmiche e al contempo coordinate e ben sincronizzate; hanno mostrato impulsi regolari simili ai complessi P-Q-R-S-T, osservati negli elettrodi applicati sulla superficie corporea negli elettrocardiogrammi clinici. Inoltre, i cardiomiociti sono in grado di mantenere una marcata contrattilit&agrave; per oltre tre mesi una volta acquisita la tecnica. Questa tecnica pu&ograve; essere utilizzata per generare in modo uniforme precursori cardiaci e cardiomiociti battenti da cellule staminali embrionali umane pluripotenti in circa cinque settimane, se eseguita correttamente.

efficient-derivation-human-cardiac-precursors-cardiomyocytes-from

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Le cellule staminali pluripotenti, sia staminali (iPS), le cellule embrionali pluripotenti o indotto, costituiscono una preziosa fonte di cellule differenziate umani, tra cardiomiociti. Qui, ci si concentrerà sulla induzione cardiaco di cellule iPS, che mostra come usarli per ottenere cardiomiociti umani funzionali attraverso un protocollo embryoid corpi-based.

Generazione di cardiomiociti umani: Un protocollo di differenziazione da alimentatore-Free umani cellule staminali pluripotenti indotte

L'articolo descrive la metodologia dettagliata per differenziare efficacemente le cellule staminali pluripotenti umane in cardiomiociti selettivamente modulando la via di Wnt, seguita da analisi citofluorimetrica di marcatori di riferimento per valutare l'omogeneità e l'identità della popolazione.

Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso

In questo protocollo, verrà illustrata la derivazione di cellule progenitrici cardiache da cellule staminali embrionali sia di topo che umane. Una delle principali strategie di questo protocollo consiste nell'arricchire le cellule progenitrici cardiache con la citometria a flusso utilizzando reporter fluorescenti ingegnerizzati nelle linee di cellule staminali embrionali.

Derivazione di cellule cardiache progenitrici di cellule staminali embrionali

Qui, descriviamo un robusto protocollo per la derivazione di cardiomiociti umani che combina la differenziazione cardiaca modulata da piccole molecole e la purificazione dei cardiomiociti mediata dalla privazione di glucosio, consentendo la produzione di cardiomiociti purificati ai fini della modellazione delle malattie cardiovascolari e dello screening dei farmaci.

Derivazione di Cardiomyocytes altamente purificato da cellule staminali umane pluripotenti indotte utilizzando piccoli Differenziazione Molecola-modulato e successiva glucosio Starvation

La generazione di cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti in vitro consente l'accesso a grandi quantità di tessuto cardiaco in vitro per la scienza di base e le applicazioni cliniche.  Questo protocollo utilizza il fattore atrializzante Grem2 sia per aumentare il numero di cardiomiociti ottenuti sia per generare cardiomiociti con un fenotipo atriale.

Differenziazione dei atriale cardiomiociti dalle cellule staminali pluripotenti utilizzando la BMP Antagonista Grem2

Qui, presentiamo un protocollo di differenziazione dei cardiomiociti robusto, veloce e scalabile per cellule staminali pluripotenti umane (hPSC). I cardiomiociti derivati utilizzando questo metodo su larga scala possono fornire un numero sufficiente di cellule per il loro uso efficace nella modellazione delle malattie cardiovascolari umane, nello screening di farmaci ad alto rendimento e potenzialmente in applicazioni cliniche.

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

La caratterizzazione elettrofisiologica dei cardiomiociti derivata da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC-CM) è fondamentale per la modellizzazione delle malattie cardiache e per la determinazione delle risposte di farmaco. Questo protocollo fornisce le informazioni necessarie per dissociare e piastrare hPSC-CM su matrici multi-elettrodi, misurare il loro potenziale di campo e un metodo per analizzare gli intervalli QT e RR.

Analisi elettrofisiologica dei cardiomiociti derivanti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC-CMs) Utilizzando matrici multi-elettrodo (MEAs)

Qui descriviamo un metodo scalabile, usando una semplice combinazione di activina A e Id1-sovraespressione di lentivirus-mediata, per generare il primo cuore campo-come progenitori cardiaci e ventricolare-come cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione del primo cuore campo-come progenitori cardiaci e ventricolare-come cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane

Qui, presentiamo un protocollo per generare ed espandere in modo robusto i cardiomiociti umani dalle cellule mononucleate del sangue periferico del paziente.

Generazione ed espansione di cardiomiociti umani da cellule mononucleate del sangue periferico del paziente

Qui viene presentato un insieme di protocolli per la generazione e la crioconservazione di sferoidi cardiaci (CS) da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall'uomo coltivati in un formato multidimensionale ad alto rendimento. Questo modello tridimensionale funziona come una solida piattaforma per la modellazione delle malattie, gli screening ad alto rendimento e mantiene la sua funzionalità dopo la crioconservazione.

Generazione, screening ad alto rendimento e biobanca di sferoidi cardiaci derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Scopri come derivare progenitori cardiaci e cardiomiociti funzionali da cellule staminali embrionali umane mediante induzione con piccole molecole come la nicotinamide. Questo protocollo semplifica la differenziazione e aumenta la resa per applicazioni terapeutiche cardiovascolari.

Derivazione efficiente dei diritti delluomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole (Video) | JoVE Journal

Derivazione efficiente dei diritti dell'uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Esplora altri video