Name: 在细胞命运 E.大肠杆菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 学习使用荧光显微镜实时追踪大肠杆菌被λ噬菌体感染后的细胞命运变化。该方法通过荧光标记技术观察裂解、溶原或未感染等不同感染结果，为病毒学与微生物学研究提供重要的实时动态数据。

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我们感谢 Michael Feiss 和 Jean Sippy 在噬菌体构建与纯化方面的指导。感谢 Michael Elowitz 提供细胞识别软件 Schnitzcell。Golding 实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（R01GM082837）、美国国家科学基金会（082265，PFC：生命细胞物理学研究中心）、Welch 基金会（Grant Q-1759）以及人类前沿科学计划（RGY 70/2008）资助项目的资助。

<ol><li>Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switches+in+bacteriophage+lambda+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Switches in bacteriophage lambda development.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 409-429 (2005).</li>
<li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22A+genetic+switch+%3A+phage+lambda+revisited%22">A genetic switch : phage lambda revisited</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).</li>
<li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHendrix%2C+RW+%22Lambda+II%22">Lambda II</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1983).</li>
<li>Hershey, A. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHershey%2C+AD+%22The+Bacteriophage+lambda%22">The Bacteriophage lambda</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1971).</li>
<li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+making+at+a+subcellular+level+determines+the+outcome+of+bacteriophage+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection.</a> Cell. 141, 682-691 (2010).</li>
<li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+infection+is+targeted+to+cellular+poles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage infection is targeted to cellular poles.</a> Mol. Microbiol. , (2008).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. , John Wiley & Sons. (1994).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFasman%2C+GD+%22Practical+handbook+of+biochemistry+and+molecular+biology%22">Practical handbook of biochemistry and molecular biology</a>. , CRC press. (1989).</li>
<li>Kaiser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+internal+structure+of+bacteriophage+lambda%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">On the internal structure of bacteriophage lambda.</a> J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).</li>
<li>Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinetic+analysis+of+the+bacteriophage+lambda+genetic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network.</a> Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Personal communication with M. Feiss. , Forthcoming.</li>
<li>Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adsorption+of+coliphage+lambda+to+its+host%3A+effect+of+variations+in+the+surface+density+of+receptor+and+in+phage-receptor+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity.</a> J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

细菌菌株、噬菌体与质粒：
菌株 LE392 为 supF 型，被选用于抑制噬菌体基因组中的 Sam7 突变（详见表1）。因此，经诱导的溶原细胞最终将裂解并释放噬菌体颗粒，选择裂解途径的感染细胞亦然。由于噬菌体基因组中含有温度敏感型 cI857 等位基因，溶原细胞需在 30°C 下培养。热诱导后，gpD-EYFP 和野生型 gpD 分别由 λLZ1 基因组和质粒 pPlate*D 共同表达。因此，新生成的噬菌体 λLZ2 的衣壳中含有 gpD-EYFP 与 gpD 蛋白的混合物。这种嵌合噬菌体结构稳定，且具有足够的荧光强度，可用于单个噬菌体的检测5。pPRE-mCherry 是一种用于检测溶原途径选择的报告质粒。启动子 PRE 在溶原建立过程中被 CII 激活1,11。pPRE-mCherry5 是通过将 pE-gfp11 中的 gfp 替换为 mCherry12 而获得。更多细节请参见我们先前的研究工作5。
培养条件参数：
在溶原性诱导过程中（第1节），以180 rpm的温和振荡可获得较高的病毒产量13。应避免在培养基中使用葡萄糖，因为葡萄糖代谢会产生酸性代谢产物，而成熟的λ噬菌体颗粒在酸性pH条件下不稳定13。添加MgSO4的目的是稳定噬菌体衣壳3。对于携带野生型cI基因（而非cI857）的噬菌体，可使用DNA损伤剂丝裂霉素C（Mitomycin C）诱导溶原菌3。在步骤1.3中，37°C孵育时间通常不应超过90分钟。建议每30分钟通过OD600检测一次细胞密度。良好的裂解液应表现为OD600下降至约0.2或更低，残留的OD600主要来自细胞碎片。孵育时间过长可能导致噬菌体产量降低，因为新生成的噬菌体可能开始将DNA注入细胞碎片中。为了在步骤2.11和2.13中获得可见的噬菌体条带（至少1 × 1011个噬菌体颗粒），在步骤1.2中应培养至少500 ml的菌液。在步骤5.1和5.2的培养基中添加0.2%麦芽糖，旨在诱导LamB的表达，LamB是λ噬菌体吸附的受体蛋白3,14。步骤5.2中采用1000倍稀释而非100倍稀释，目的是降低报告质粒pPRE-mCherry带来的mCherry背景信号水平。在步骤5.5中进行噬菌体DNA注入触发时，选择35°C是为了避免诱导温度敏感型cI857等位基因的表达。
噬菌体纯化：
噬菌体纯化步骤（步骤 2.1 至 2.11）可用其他纯化方案替代5，但最终通过 CsCl 平衡梯度进行超速离心（步骤 2.12 和 2.13）是必不可少的。在步骤 2.10 和 2.12 中需要使用摆动桶转子，以确保噬菌体条带清晰可见。获得纯化的噬菌体储备液可能需要长达一周的时间，因此有必要在过程中检测噬菌体滴度，以确保中间步骤未出现差错。
噬菌体操作：
在第2节的所有纯化步骤中，必须轻柔操作噬菌体裂解液，以避免噬菌体尾部从头部脱落。在第5节的细胞感染过程中（例如，步骤5.5至5.7），也必须避免噬菌体颗粒从感染细胞中发生剪切。需要注意的是，如果噬菌体在将其DNA注入细胞后从细胞上脱落，则会导致“暗感染”现象，即实验中可观察到感染结果，但无法检测到感染性噬菌体。为尽量减少此类问题，我们在操作噬菌体或噬菌体/细胞混合物时，均使用宽口移液管头。
DAPI 检测：
用 DAPI 染色噬菌体原液（第 4 节）是一种快速且高效的方法，用于检测噬菌体原液的纯度，也可用于检测现有噬菌体原液随时间可能发生降解的情况。对于纯度较高的原液，在荧光显微镜下 YFP 与 DAPI 信号的共定位率应接近 100%。我们通常观察到少于 1% 的 YFP 斑点不含 DAPI 信号（代表无病毒基因组的衣壳），这表明这些颗粒未能成功包装病毒 DNA，或已将 DNA 注入其他位置。少于 1% 的 DAPI 斑点不含 YFP 信号（对应于无荧光的噬菌体）。如果情况不符合上述标准，则需要重复步骤 2.12 至 2.14，以进行再次纯化。关于成像参数，步骤 4.3 中的显微镜设置不如第 5 节关键，因为此处无需进行长期活细胞成像。然而，若希望校准单个噬菌体颗粒的荧光强度，则保持与第 5 节相同的显微镜设置是有益的。如果 PBS-琼脂糖薄片不够洁净，或使用了过多的 DAPI 染料，则部分对应于噬菌体 DNA 的 DAPI 斑点周围可能出现“光晕”现象。若 DAPI 染料用量过少，则 DAPI 通道的信号可能非常微弱。
显微镜系统：
在第6节的成像中，我们使用一台商用倒置落射荧光显微镜（Eclipse TE2000-E，Nikon），配备100倍物镜（Plan Fluo，数值孔径1.40，油浸）和标准滤光片组（Nikon）。荧光光源为弧光灯，并可调节光照强度。以下功能均由计算机控制：x、y和z轴位置；明场和荧光快门；以及荧光滤光片的选择。必须具备自动对焦功能，否则在延时成像过程中（通常持续4小时）焦点容易发生漂移。在每个时间点采集多个（x, y）位置的功能非常有用，因为它允许同时追踪多个感染事件。我们通常在每段延时影片中采集8个载物台位置，以并行监测多达100个感染事件。所使用的相机为冷却型512×512 CCD相机，像素大小为16×16 μm，动态范围为16位（Cascade512，Photometrics）。图像采集使用MetaMorph软件（Molecular Devices）完成。显微镜应置于温度可控的房间内；或者，显微镜载物台应配备温控培养舱。
图像采集：
进行活细胞成像时，关键是要避免对样品进行不必要的光照，以免导致荧光淬灭和光毒性。因此，最好首先对系统进行表征，以确定最佳的光照条件，在保证荧光信号可检测的同时，避免过度淬灭或抑制细胞生长。为了获得良好的荧光图像，需调整激发光强度、曝光时间和相机增益。在步骤6.2–6.3中，选择10分钟的帧间隔是为了尽量减少光照暴露。在每一帧中，明场通道（用于识别细胞）和荧光通道（用于确定细胞命运）仅需采集一幅处于焦平面的单层图像。然而，在第一个时间点，需要通过YFP通道在多个z轴位置采集图像，以捕获细胞表面所有感染中的噬菌体。此外，初始帧中YFP通道的曝光时间可能需要高于后续时间点延时成像所使用的曝光时间。
图像分析：
在步骤 7.1 中需极其仔细地计数细胞表面周围的噬菌体颗粒。如上所述，我们在步骤 6.2 中通过 YFP 通道采集一系列 z 层扫描图像。然而，这仍可能导致部分荧光标记的噬菌体颗粒处于失焦状态，从而给计数带来困难。初始时间点的细胞长度使用 Metamorph 软件进行测量，也可通过 ImageJ 或其他软件工具测定。此外，自行开发的自动化 Matlab 程序在获取沿细胞谱系随时间变化的荧光信号信息方面具有重要价值。

<table><tbody><tr><td>氯仿</td><td>费舍尔科技公司</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>费舍尔科技公司</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>D4527-10KU</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>R4642-10MG</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>费舍尔科技公司</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>SM 缓冲液</td><td>TEKnova 公司</td><td>S0249</td><td></td></tr><tr><td>NZYM</td><td>TEKnova 公司</td><td>N2062</td><td></td></tr><tr><td>氯化铯</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>C3011-250G</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD 生物科学公司</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>BD 生物科学公司</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>透析盒</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>66333</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>康宁公司</td><td>2947-75x50</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>费舍尔科技公司</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>SW40Ti 超透明离心管</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>344060</td><td></td></tr><tr><td>SW60Ti 超透明离心管</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>344062</td><td></td></tr><tr><td>SW40Ti 转头</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>331302</td><td></td></tr><tr><td>SW60Ti 转头</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>折射仪</td><td>费舍尔科技公司</td><td>13-947</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>尼康仪器公司</td><td>Eclipse TE2000-E</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 2.&lt;/strong&gt; 试剂与设备。</td></tr></tbody></table>

追踪细胞命运 大肠杆菌 λ噬菌体感染后

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

由噬菌体（噬菌体）λ和大肠杆菌（E. coli）组成的系统长期以来被用作细胞命运决定的典范模型1,2。当多个噬菌体同时感染一个细胞后，细胞将选择两条通路之一：裂解（毒性）途径或溶原（潜伏）途径3,4。我们近期开发了一种对单个噬菌体进行荧光标记的方法，能够在显微镜下实时观察感染后的决策过程，达到单个噬菌体和单个细胞的分辨率5。本文中，我们详细描述了此前研究所述感染实验的完整操作流程5，包括荧光噬菌体的构建、细胞感染、显微成像以及数据分析。该荧光噬菌体为一种“杂合体”，可同时表达野生型和YFP融合型的衣壳蛋白gpD。首先通过诱导携带表达野生型gpD蛋白质粒的gpD-EYFP（增强型黄色荧光蛋白）噬菌体溶原菌，获得粗制噬菌体裂解液。随后进行一系列纯化步骤，接着用DAPI标记并在显微镜下成像，以验证噬菌体储备液的均一性、DNA包装效率、荧光信号强度以及结构稳定性。噬菌体与细菌的初始吸附在冰上进行，随后短暂孵育于35°C以触发病毒DNA的注入6。然后将噬菌体与细菌的混合物转移至薄层营养琼脂平板表面，加盖盖玻片，并在落射荧光显微镜下进行观察。感染后过程持续追踪4小时，每10分钟采集一次图像。通过追踪多个视野位置，单次实验可记录约100个细胞的感染过程。在每个位置和时间点，同步采集相差图像以及红色和绿色荧光通道的图像。后续利用相差图像实现细胞的自动识别，而荧光通道则用于判断感染结果：若观察到新荧光噬菌体（绿色）的产生并伴随细胞裂解，则为裂解途径；若检测到溶原性因子的表达（红色）并伴随细胞恢复生长与分裂，则为溶原途径。所获得的时间序列视频数据通过手动与自动方法相结合进行处理。数据分析可确定每次感染事件的相关参数（如感染噬菌体的数量与位置）以及感染结局（裂解/溶原）。根据需要还可提取其他参数。

本文介绍了制备荧光标记的λ噬菌体、感染大肠杆菌（E. coli）、在显微镜下观察感染过程以及分析感染结果的实验步骤。

由噬菌体λ（phage lambda）和大肠杆菌（E. coli）组成的系统长期以来一直是细胞命运决定研究的典范1,2。在……之后

本实验的总体目标是利用荧光显微镜实时追踪λ噬菌体感染大肠杆菌后其中硫酸盐的变化。首先制备λ噬菌体的粗裂解液，然后纯化噬菌体，并在离心管中用λ噬菌体感染大肠杆菌。继续在显微镜下观察细菌细胞的命运。最终，该结果可实时显示大肠杆菌中不同的细胞命运，这些差异通过与细胞生长或死亡相关的不同荧光蛋白的表达来呈现。通常，该方法的一个关键步骤在于制备纯净的前体并标记FI储备液。为避免在制备和纯化过程中发生噬菌体共享，还需在显微镜下优化成像参数，以促进健康细胞的接种生长。将 E392 λLZ1 PPL* D 菌株的过夜培养物以约 0.6 的 OD600 细胞密度接种至 LBM 培养基中，并在 42 °C 水浴摇床中诱导溶原化。在37摄氏度下继续孵育，直至裂解现象明显。此时培养物会变得澄清。加入2%氯仿，然后在室温下孵育15分钟。接下来，将噬菌体裂解液转移至250毫升瓶中，并对培养物进行离心。然后收集含有噬菌体颗粒的上清液，并按照标准噬菌体滴定方案进行第二次离心，以去除可见的碎片。测定噬菌体浓度，再通过氯化铯梯度纯化噬菌体，并采用DPI检测其活性，以制备aro平板。用70%乙醇清洁六张载玻片。将其中五张载玻片按图示排列，并用胶带固定。然后将含有1.5% aros的培养基溶液倒入固定好的载玻片上。将最后一张载玻片置于顶部，小心避免产生气泡。放置重物压紧，使AROS冷却约30分钟。移除侧面的四张载玻片，用保鲜膜包裹载玻片块进行封装。以转化细菌的过夜培养物作为接种物，在LBMM中培养细菌，取一毫升菌液进行沉淀，并用20微升预冷的LBMM重悬细胞，使用宽口吸头操作。加入20 µL纯化的噬菌体。轻轻混匀，先在冰上孵育30分钟，以使噬菌体吸附。随后在35 °C水浴中孵育5分钟。为诱导噬菌体DNA注入，通过混匀分散任何细胞聚集体。将混合物按1:10比例稀释至LBMM中。然后放置一块LBM琼脂平板。在盖玻片上加入一微升噬菌体细胞混合液。待其吸附后，轻柔地将另一张盖玻片覆盖在上方。首先通过YFP通道采集初始时间点的图像序列。在 Z 轴方向以 200 纳米的间隔采集一系列 15 张图像。此外，通过相差和 mCherry 通道各采集一张聚焦清晰的单张图像。然后对感染后的细胞命运进行延时成像。为在延时成像过程中尽量减少光漂白和光毒性，每个时间点的每个通道仅采集一个Z平面图像，以相差、YFP和mCherry通道对样品进行成像，时间间隔为10分钟，持续约4小时。图像分析开始时，首先手动计数噬菌体，并记录噬菌体位置及细胞长度。在初始时间范围内，记录细胞的命运状态：裂解、溶原或未感染。还可以通过播放延时电影记录裂解时间及其他所需信息，并利用自动细胞识别和谱系追踪算法，提取单个细胞随时间变化的荧光强度等更定量的信息。通常，荧光标记噬菌体形成的噬斑明显小于野生型噬菌体，且成功纯化的噬菌体的YFP与DAPI信号共定位。这些数据整合了相差、YFP和mCherry通道的图像集，以及来自延时电影的相应叠加图像。在初始时间点可以清楚地观察到单个噬菌体。此处可见两个细胞各自被一个噬菌体感染，另一个细胞被三个噬菌体感染。通常，可在细胞表面观察到一定数量的噬菌体，而其他噬菌体则尚未被吸附。随着时间推移，感染结果逐渐变得可区分。80分钟后，被单个噬菌体感染的两个细胞均已进入裂解途径。而被三个噬菌体感染的细胞则因前启动子驱动mCherry的表达，已进入溶原途径。观看本视频后，您应充分了解如何制备纯化的噬菌体储备液，以λ噬菌体感染大肠杆菌，并在显微镜下实时进行生活周期成像。

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Immunology and Infection

免疫学与感染

在细胞命运<em&gt; E.大肠杆菌</em感染后的噬菌体λ

来源：Saragliadis, A., 等．利用可切除抗生素抗性盒通过P1转导在Escherichia coli中构建基因缺失．J. Vis. Exp. （2018）本视频展示了通过噬菌体介导的方式，将携带可切除抗生素抗性盒的供体DNA转入大肠杆菌（Escherichia...

通过噬菌体介导的可切除抗生素盒转移在 E. coli 中实现基因缺失

新一代无细胞转录-翻译平台已被设计用于构建生化系统 体外 通过基因回路的执行。在本文中，我们描述了如何利用全基因组合成方法，从其基因组合成噬菌体，如MS2、ΦΧ174和T7 E. coli...

合成具有感染性的噬菌体 大肠杆菌-基于细胞的无细胞表达系统

本文介绍一种利用已有的抗生素抗性盒缺失构建体作为基础，在其他大肠杆菌（E.

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应用活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征的 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统

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单分子成像观察EWS-FLI1凝聚体在DNA上的组装

噬菌体（phages）是一类感染细菌的病毒，是肠道微生物组的重要组成部分。尽管这些共生微生物影响着细菌的适应性和种群动态，但其对肠道稳态及疾病的影响机制仍知之甚少。本实验方案采用小鼠模型研究分离的T4噬菌体，该方法可适用于其他噬菌体-细菌组合的研究。...

T4 噬菌体与小鼠肠道内E. coli的相互作用：研究宿主-噬菌体体内动态关系的典型模型

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伯克霍尔德菌属（Burkholderia）成员是具有重要临床意义的病原体。本文介绍一种利用机械破碎法进行细菌总蛋白提取，并结合二维凝胶电泳进行后续蛋白质组学分析的方法。...

总蛋白提取与二维凝胶电泳方法 伯克霍尔德菌属 物种

本文描述了一种可视化的方法，用于从噬菌体展示的组合合成抗体文库中，同时针对数百种抗原进行可扩展的高通量筛选。通过这种并行方法，我们分离出的抗体片段对多种抗原具有高亲和力和特异性，并可在标准免疫测定中发挥功能。...

可扩展的高通量噬菌体展示合成抗体文库筛选

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