Rivelando Topografia Neural Circuit in Multi-Color

Questa procedura descrive un protocollo versatile di tracciamento in vivo che sfrutta la glutelina del germe di grano coniugata con fluorocromi Alexa per tracciare i circuiti neuronali. In primo luogo, viene effettuata un'incisione nella regione toracica inferiore e nella regione lombare superiore, e vengono recisi la fascia e i muscoli spinali superficiali. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire una laminectomia dorsale.

Successivamente, l'elettrodo microscopico viene posizionato e fissato al micromanipolatore. Segue l'iniezione sotto pressione di traccianti neurali nel midollo spinale. L'ultimo passaggio di questa procedura consiste nell'assicurare un'adeguata assistenza post-chirurgica durante il periodo di recupero e nel concedere un tempo sufficiente affinché i traccianti vengano trasportati lungo i tratti bersaglio.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'organizzazione e la connettività delle mappe topografiche nella corteccia cerebellare, nel tronco encefalico e nel midollo spinale mediante microscopia a immunofluorescenza. Il principale vantaggio di questo tracciante rispetto ai traccianti esistenti come BDA o W-G-A-H-R-P è che i traccianti WGA Alexa sono abbastanza luminosi da permettere l'acquisizione di immagini direttamente su preparati in toto subito dopo il tracciamento. Questo metodo potrebbe contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neuroscienza dei sistemi, come ad esempio quale sia la logica alla base del patterning globale di molteplici proiezioni topografiche all'interno e tra i sistemi corticale, cerebellare, del tronco encefalico e spinale prima di iniziare la procedura.

Assicurarsi che tutte le manipolazioni siano conformi alle linee guida del comitato iacuc, che sia disponibile un campo sterile per l'intervento chirurgico e che tutti gli strumenti da utilizzare siano stati sterilizzati. Dopo aver somministrato un anestetico approvato all'animale, si devono utilizzare tecniche chirurgiche sterili per tutta la durata dell'intervento; verificare che sia stato raggiunto un adeguato livello di anestesia eseguendo una compressione del dito del piede. Il riflesso plantare deve essere assente una volta che l'animale è completamente anestetizzato.

Rasare il pelo sulla zona da operare con un rasoio per capelli. Successivamente, posizionare l'animale in posizione dorsale su un tampone di garza sterile utilizzando un movimento circolare che procede dall'interno verso l'esterno. Pulire la zona rasata con due set di salviette alcoliche, quindi con Betadine al 70% in alcol.

Quindi, pulire nuovamente con salviette alcoliche, quindi delimitare chiaramente il campo operatorio posizionando un cerotto sterile con un piccolo foro tagliato al centro sull'animale dopo che è stato adeguatamente preparato. In questo modo, procedere all'intervento chirurgico mantenendo una corretta tecnica chirurgica sterile. Sollevare la pelle utilizzando pinze e praticare un'incisione con forbici lungo la linea mediana direttamente sopra la regione toracica inferiore e lombare superiore.

Tagliare la fascia e i muscoli spinali superficiali se necessario, arrestare qualsiasi sanguinamento cauterizzando i vasi sanguigni. Quindi identificare il punto intermedio tra il processo articolare e il processo spinoso dorsale, e tagliare la lamina in questo punto su entrambi i lati della colonna vertebrale. Successivamente, eseguire una laminectomia dorsale rimuovendo i processi spinosi di uno o due segmenti del midollo spinale toracico inferiore e lombare superiore.

Utilizzando una siringa micrometrica, riempire una pipetta di vetro con il tracciante. Successivamente, fissare saldamente la microelettroda di vetro al micro-manipolatore. Poi, riempire l'ago con i reagenti.

Inserire la pipetta con il campione combinato da 0,1 a 0,5 millimetri nella regione toracica inferiore e lombare superiore del midollo spinale. A metà strada tra la linea mediana e il margine laterale del midollo spinale, iniettare per pressione circa 0,5 microlitri di una soluzione al 2% di coniugato di agglutinina del grano LOR, agglutinina del germe di grano, coniugato della perossidasi del ravanello, oppure al 10% di dextrano ammina biotinilata in PBS integrato con 0,5% di verde rapido, nell'arco di tre-cinque minuti. Se il tracciante non fuoriesce facilmente dalla pipetta, ritirare lentamente la punta per creare una piccola cavità nel tessuto.

Quindi provare a iniettare nuovamente dopo il completamento della microiniezione. Chiudere delicatamente la pelle con clip per ferite e colla tissutale. Successivamente, posizionare l'animale in una camera di recupero su un tappetino riscaldante.

Monitorare la frequenza respiratoria e verificare i segni di tentativo di movimento dell'animale. Dopo che l'animale si è ripreso dall'anestesia, riporlo nella gabbia di mantenimento e fornire acqua e cibo ad libitum e analgesici secondo necessità. Controllare regolarmente segni di dolore, disagio o infezione e una corretta alimentazione e idratazione; gli animali a cui sono stati iniettati traccianti di glutine del germe di grano e coniugati vengono sacrificati.

24 ore dopo la microiniezione. Il BDA richiede tipicamente tempi di sopravvivenza più lunghi per tracciare completamente le proiezioni neurali e, di conseguenza, la mappatura completa delle proiezioni spinocerebellari. Questi animali vengono sacrificati dopo circa 11 giorni.

Sono state iniettate tracce di glutinina di germe di grano marcate con Alexa nel midollo spinale toracico inferiore e lombare superiore. Questo schema illustra l'origine e il termine della glutinina di germe di grano. Neuroni spinocerebellari marcati con Alexa 555.

Questa figura mostra il sito di iniezione dopo la somministrazione di agglutinina di germe di grano Alexa 5 55 nella regione toracica inferiore e lombare superiore del midollo spinale adulto. Questa immagine in preparato intero mostra i lobi anteriori a seguito dell'iniezione di germe di grano. Gemma Glutenina.

Alexa 555 nel segmento toracico inferiore e lombare superiore del midollo spinale. I lobi sono indicati con numeri romani. Qui osserviamo che la tracciatura anterograda con Alexa 555 dell'anticorpo anti-glutenina del germe di grano rivela bande ben definite di fibre muschiose, come visibile in questa sezione coronale del tessuto.

Questo schema del cervelletto del mouse riassume il modello generale del cervelletto spinale. Le bande di fibre muscoidi wheatgermagluten coniugato ad Alexa 555 sono state iniettate nel lato destro del midollo spinale lombare e wheatgermagluten coniugato ad Alexa 488 nello stesso segmento del lato sinistro, come visibile in una sezione tissutale coronale attraverso le LOEs posteriori.

Entrambi i traccianti Alexa di agglutinina Weger sono stati trasportati al cervelletto e hanno etichettato con successo sottoinsiemi distinti di terminali delle fibre muscose, principalmente nello strato delle cellule granulari, indicato come GCL. I traccianti Alexa di agglutinina Weger possono essere utilizzati in combinazione con immunohistochimica e istologia per l'etichettatura tripla di neuroni e proiezioni. Qui, l'agglutinina Weger Alexa 5 55 è depositata nei terminali delle fibre muscose nel labbro tre. Questa immagine ad ingrandimento maggiore della regione delimitata illustra un'etichettatura chiara dei terminali delle fibre muscose.

Questa immagine della colorazione di zein due rivela una serie di strisce di cellule bikini in Lole tre. Questa immagine a ingrandimento maggiore della regione delimitata mostra un'etichettatura chiara delle cellule bikini nello strato delle cellule bikini e nello strato molecolare. Qui la colorazione con DPI rivela i nuclei dei neuroni e delle cellule gliali.

Questa immagine ad alta potenza della regione evidenziata mostra un'intensa marcatura del livello granulare ricco di nuclei e del livello delle cellule bikini, e una marcatura meno densa nel livello molecolare. Qui emerge un'immagine che mostra una tripla marcatura mediante Wheatgerm Agglutinin, Alexa 5 55 serin two e DPI di bande afferenti, strisce di cellule bikini e dell'architettura citologica generale. Infine, questa immagine ad alta potenza della regione evidenziata illustra chiaramente l'efficacia di questa tecnica nel rivelare l'architettura citologica delle strutture cerebrali.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 minuti per animale se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di acquisire l'immagine del tessuto immediatamente dopo il taglio. Tuttavia, l'acquisizione entro due giorni dal taglio consente ancora di visualizzare con successo le fibre e i terminali marcati seguendo questa procedura.

Altri metodi, come il tracciamento genetico della linea cellulare, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio: quali sono i modelli di proiezione e i modelli di terminazione delle popolazioni cellulari definite geneticamente?