Name: Rivelando Topografia Neural Circuit in Multi-Color (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Scopri il tracciamento in vivo dei circuiti neurali con WGA-Alexa fluorofori nel midollo spinale di topo. Questo metodo consente la visualizzazione tridimensionale delle proiezioni topografiche nel cervelletto e nel sistema nervoso centrale.

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Questo lavoro è stato sostenuto da investigatore nuove start-up fondi da Albert Einstein College of Medicine della Yeshiva University di RVS.

<ol><li>Apps, R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+cortical+organization%3A+a+one-map+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).</li>
<li>Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+prenatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse.</a> J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).</li>
<li>Mesulam, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMesulam%2C+M+%22Tracing+neural+connections+with+horseradish+peroxidase%22">Tracing neural connections with horseradish peroxidase</a>. , Wiley. New York. (1982).</li>
<li>Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+expression+of+a+cocaine-+and+amphetamine+regulated+transcript+%28CART%29+peptide+reveals+complex+circuit+topography+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li>
<li>Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+mapping+of+afferent+topography+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions.</a> Brain. Struct. Funct. , (2011).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+determine+the+organization+of+Purkinje+cell+sagittal+stripe+gene+expression+in+the+adult+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum.</a> J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+regulate+establishment+of+the+cerebellar+afferent+circuit+map%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map.</a> J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).</li>
<li>Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+the+reeler+cerebellum%3A+segregation+and+overlap+of+spinocerebellar+and+secondary+vestibulocerebellar+fibers+and+their+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells.</a> Neuroscience. 130, 735-744 (2005).</li>
<li>Vogel, M. W., Prittie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+spinocerebellar+mossy+fiber+projections+are+maintained+in+the+lurcher+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant.</a> J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).</li>
<li>Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medio-lateral+distribution+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+anterior+lobe+and+the+simple+lobule+in+the+cat+and+a+comparison+with+some+other+afferent+fibre+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatr.+Neurol.+Neurochir%22%5BJournal%5D)">The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems.</a> Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).</li>
<li>Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+patterns+of+single+mossy+fibers+originating+from+the+lateral+reticular+nucleus+in+the+rat+cerebellar+cortex+and+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei.</a> J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo descritto i dettagli chirurgiche e tecniche necessarie per il successo tracciamento degli assoni e dendriti utilizzando un nuovo approccio basato fluorescente per rapidamente l&#39;etichettatura proiezioni neurali nello sviluppo e topi adulti. Utilizzando WGA-Alexa si mostra come traccianti e marcatori possono essere usati per analizzare la topografia del circuito modellata ad alta risoluzione e in tre dimensioni. Traccianti molti sono disponibili per il tracciamento circuiti neurona...

<table border="1"><tbody><tr><td> Attrezzature / reagenti </td><td> Modello / Numero di catalogo </td><td> Azienda </td></tr><tr><td> Tallone sterilizzatore </td><td> Modello Steri 250 cat. # 18000-45 </td><td> Strumenti Scienza multa </td></tr><tr><td> Cauterizer </td><td> Gatto. # 18000-00 </td><td> Strumenti Scienza multa </td></tr><tr><td> Vetro borosilicato capillari </td><td> Gatto. # 300056 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Doppio stadio di vetro Micropipetta Puller </td><td> Modello 001-PC-10 </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> Micrometro siringa </td><td> Gatto. # GS-1100 </td><td> Gilmont Instruments </td></tr><tr><td> Piccoli Animali Strumento Stereotassica </td><td> Modello 940-A </td><td> Kopf Strumentazione </td></tr><tr><td> Elettrodo Manipolatore </td><td> Modello 960 </td><td> Kopf Strumentazione </td></tr><tr><td> Vetcare camera </td><td> Gatto. #340508 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Riscaldamento Pad </td><td> Gatto. # 341241 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Leica DFC360 FX fotocamera </td><td> DFC360 FX </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DFC490 fotocamera </td><td> DFC490 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DM5500 Microscopio </td><td> DM5500 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DFC3000 fotocamera FX </td><td> DFC3000 FX </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica MZ16 FA microscopio </td><td> MZ16 FA </td><td> Leica </td></tr><tr><td> CY3 Filtro </td><td> Modello # 11600231 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> FITC Filtro </td><td> Modello # 11513880 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> A4 DAPI / filtro UV </td><td> Modello # 11504162 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Germe di grano agglutinina, Alexa Fluor 488 coniugato </td><td> Gatto. # W11261 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Grano germ agglutinina, Alexa Fluor 555 coniugato </td><td> Gatto. # W32464 </td><td> Invitrogen </td></tr></tbody></table>

rivelando topografia neural circuit in multi-color

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Circuiti neurali sono organizzate in funzionali mappe topografiche. Al fine di visualizzare complessa architettura del circuito, abbiamo sviluppato un metodo affidabile per etichettare il modello globale di molteplici proiezioni topografiche. Il cervelletto è un modello ideale per studiare la disposizione ordinata dei circuiti neurali. Per esempio, l&#39;organizzazione compartimentale dei spinocerebellare fibre muschio ha dimostrato di essere un sistema indispensabile per lo studio di patterning muschio fibra. Abbiamo recentemente dimostrato che il germe di grano agglutinina (WGA), coniugata con Alexa 555 e 488 può essere utilizzato per il tracciamento spinocerebellare proiezioni in fibra di muschio nello sviluppo e topi adulti (Reeber et al. 2011). Abbiamo trovato tre proprietà principali che rendono il WGA-Alexa strumenti traccianti auspicabile per l&#39;etichettatura di proiezioni neurali. In primo luogo, fluorofori Alexa sono intensi e la loro luminosità permette l&#39;imaging wholemount subito dopo traccia. In secondo luogo, WGA-Alexa traccianti etichetta l&#39;intera traiettoria di sviluppo e di adulti neurali projections. In terzo luogo, WGA-Alexa rivelatori rapidamente trasportato sia in direzione retrograda e anterograda. Qui, descriviamo in dettaglio come preparare i traccianti e altri strumenti necessari, come eseguire l&#39;intervento chirurgico per spinocerebellare tracciamento e il modo migliore per proiezioni di immagini tracciate in tre dimensioni. In sintesi, forniamo un passo-passo il protocollo di analisi che sarà utile per decifrare l&#39;organizzazione e la connettività di mappe funzionali non solo nel cervelletto, ma anche nella corteccia, tronco encefalico e del midollo spinale.

Forniamo una guida pratica per fornire traccianti<em&gt; In vivo</em&gt; E usare il percorso spinocerebellare come sistema modello per dimostrare passi essenziali per il successo dei circuiti neuronali nei topi. Descriviamo in dettaglio nostro protocollo versatile di analisi che sfrutta germe di grano agglutinina (WGA), coniugata con fluorofori Alexa.

Rivelando Topografia Neural Circuit in Multi-Color

I circuiti neurali sono organizzati in mappe topografiche funzionali. Al fine di visualizzare l'architettura di circuiti complessi, abbiamo sviluppato un approccio per...

Questa procedura descrive un protocollo versatile di tracciamento in vivo che sfrutta la glutelina del germe di grano coniugata con fluorocromi Alexa per tracciare i circuiti neuronali. In primo luogo, viene effettuata un'incisione nella regione toracica inferiore e nella regione lombare superiore, e vengono recisi la fascia e i muscoli spinali superficiali. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire una laminectomia dorsale.Successivamente, l'elettrodo microscopico viene posizionato e fissato al micromanipolatore. Segue l'iniezione sotto pressione di traccianti neurali nel midollo spinale. L'ultimo passaggio di questa procedura consiste nell'assicurare un'adeguata assistenza post-chirurgica durante il periodo di recupero e nel concedere un tempo sufficiente affinché i traccianti vengano trasportati lungo i tratti bersaglio.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'organizzazione e la connettività delle mappe topografiche nella corteccia cerebellare, nel tronco encefalico e nel midollo spinale mediante microscopia a immunofluorescenza. Il principale vantaggio di questo tracciante rispetto ai traccianti esistenti come BDA o W-G-A-H-R-P è che i traccianti WGA Alexa sono abbastanza luminosi da permettere l'acquisizione di immagini direttamente su preparati in toto subito dopo il tracciamento. Questo metodo potrebbe contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neuroscienza dei sistemi, come ad esempio quale sia la logica alla base del patterning globale di molteplici proiezioni topografiche all'interno e tra i sistemi corticale, cerebellare, del tronco encefalico e spinale prima di iniziare la procedura.Assicurarsi che tutte le manipolazioni siano conformi alle linee guida del comitato iacuc, che sia disponibile un campo sterile per l'intervento chirurgico e che tutti gli strumenti da utilizzare siano stati sterilizzati. Dopo aver somministrato un anestetico approvato all'animale, si devono utilizzare tecniche chirurgiche sterili per tutta la durata dell'intervento; verificare che sia stato raggiunto un adeguato livello di anestesia eseguendo una compressione del dito del piede. Il riflesso plantare deve essere assente una volta che l'animale è completamente anestetizzato.Rasare il pelo sulla zona da operare con un rasoio per capelli. Successivamente, posizionare l'animale in posizione dorsale su un tampone di garza sterile utilizzando un movimento circolare che procede dall'interno verso l'esterno. Pulire la zona rasata con due set di salviette alcoliche, quindi con Betadine al 70% in alcol.Quindi, pulire nuovamente con salviette alcoliche, quindi delimitare chiaramente il campo operatorio posizionando un cerotto sterile con un piccolo foro tagliato al centro sull'animale dopo che è stato adeguatamente preparato. In questo modo, procedere all'intervento chirurgico mantenendo una corretta tecnica chirurgica sterile. Sollevare la pelle utilizzando pinze e praticare un'incisione con forbici lungo la linea mediana direttamente sopra la regione toracica inferiore e lombare superiore.Tagliare la fascia e i muscoli spinali superficiali se necessario, arrestare qualsiasi sanguinamento cauterizzando i vasi sanguigni. Quindi identificare il punto intermedio tra il processo articolare e il processo spinoso dorsale, e tagliare la lamina in questo punto su entrambi i lati della colonna vertebrale. Successivamente, eseguire una laminectomia dorsale rimuovendo i processi spinosi di uno o due segmenti del midollo spinale toracico inferiore e lombare superiore.Utilizzando una siringa micrometrica, riempire una pipetta di vetro con il tracciante. Successivamente, fissare saldamente la microelettroda di vetro al micro-manipolatore. Poi, riempire l'ago con i reagenti.Inserire la pipetta con il campione combinato da 0,1 a 0,5 millimetri nella regione toracica inferiore e lombare superiore del midollo spinale. A metà strada tra la linea mediana e il margine laterale del midollo spinale, iniettare per pressione circa 0,5 microlitri di una soluzione al 2% di coniugato di agglutinina del grano LOR, agglutinina del germe di grano, coniugato della perossidasi del ravanello, oppure al 10% di dextrano ammina biotinilata in PBS integrato con 0,5% di verde rapido, nell'arco di tre-cinque minuti. Se il tracciante non fuoriesce facilmente dalla pipetta, ritirare lentamente la punta per creare una piccola cavità nel tessuto.Quindi provare a iniettare nuovamente dopo il completamento della microiniezione. Chiudere delicatamente la pelle con clip per ferite e colla tissutale. Successivamente, posizionare l'animale in una camera di recupero su un tappetino riscaldante.Monitorare la frequenza respiratoria e verificare i segni di tentativo di movimento dell'animale. Dopo che l'animale si è ripreso dall'anestesia, riporlo nella gabbia di mantenimento e fornire acqua e cibo ad libitum e analgesici secondo necessità. Controllare regolarmente segni di dolore, disagio o infezione e una corretta alimentazione e idratazione; gli animali a cui sono stati iniettati traccianti di glutine del germe di grano e coniugati vengono sacrificati.24 ore dopo la microiniezione. Il BDA richiede tipicamente tempi di sopravvivenza più lunghi per tracciare completamente le proiezioni neurali e, di conseguenza, la mappatura completa delle proiezioni spinocerebellari. Questi animali vengono sacrificati dopo circa 11 giorni.Sono state iniettate tracce di glutinina di germe di grano marcate con Alexa nel midollo spinale toracico inferiore e lombare superiore. Questo schema illustra l'origine e il termine della glutinina di germe di grano. Neuroni spinocerebellari marcati con Alexa 555.Questa figura mostra il sito di iniezione dopo la somministrazione di agglutinina di germe di grano Alexa 5 55 nella regione toracica inferiore e lombare superiore del midollo spinale adulto. Questa immagine in preparato intero mostra i lobi anteriori a seguito dell'iniezione di germe di grano. Gemma Glutenina.Alexa 555 nel segmento toracico inferiore e lombare superiore del midollo spinale. I lobi sono indicati con numeri romani. Qui osserviamo che la tracciatura anterograda con Alexa 555 dell'anticorpo anti-glutenina del germe di grano rivela bande ben definite di fibre muschiose, come visibile in questa sezione coronale del tessuto.Questo schema del cervelletto del mouse riassume il modello generale del cervelletto spinale. Le bande di fibre muscoidi wheatgermagluten coniugato ad Alexa 555 sono state iniettate nel lato destro del midollo spinale lombare e wheatgermagluten coniugato ad Alexa 488 nello stesso segmento del lato sinistro, come visibile in una sezione tissutale coronale attraverso le LOEs posteriori.Entrambi i traccianti Alexa di agglutinina Weger sono stati trasportati al cervelletto e hanno etichettato con successo sottoinsiemi distinti di terminali delle fibre muscose, principalmente nello strato delle cellule granulari, indicato come GCL. I traccianti Alexa di agglutinina Weger possono essere utilizzati in combinazione con immunohistochimica e istologia per l'etichettatura tripla di neuroni e proiezioni. Qui, l'agglutinina Weger Alexa 5 55 è depositata nei terminali delle fibre muscose nel labbro tre. Questa immagine ad ingrandimento maggiore della regione delimitata illustra un'etichettatura chiara dei terminali delle fibre muscose.Questa immagine della colorazione di zein due rivela una serie di strisce di cellule bikini in Lole tre. Questa immagine a ingrandimento maggiore della regione delimitata mostra un'etichettatura chiara delle cellule bikini nello strato delle cellule bikini e nello strato molecolare. Qui la colorazione con DPI rivela i nuclei dei neuroni e delle cellule gliali.Questa immagine ad alta potenza della regione evidenziata mostra un'intensa marcatura del livello granulare ricco di nuclei e del livello delle cellule bikini, e una marcatura meno densa nel livello molecolare. Qui emerge un'immagine che mostra una tripla marcatura mediante Wheatgerm Agglutinin, Alexa 5 55 serin two e DPI di bande afferenti, strisce di cellule bikini e dell'architettura citologica generale. Infine, questa immagine ad alta potenza della regione evidenziata illustra chiaramente l'efficacia di questa tecnica nel rivelare l'architettura citologica delle strutture cerebrali.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 minuti per animale se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di acquisire l'immagine del tessuto immediatamente dopo il taglio. Tuttavia, l'acquisizione entro due giorni dal taglio consente ancora di visualizzare con successo le fibre e i terminali marcati seguendo questa procedura.Altri metodi, come il tracciamento genetico della linea cellulare, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio: quali sono i modelli di proiezione e i modelli di terminazione delle popolazioni cellulari definite geneticamente?

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