La costrizione cronica del nervo sciatico e Ipersensibilità Testing Pain in Rats

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire una costrizione cronica del nervo sciatico, un modello comunemente utilizzato nei roditori per lo studio del dolore neuropatico, e misurare in modo quantitativo i comportamenti dolorosi risultanti. Questo viene ottenuto posizionando innanzitutto quattro legature in guttaperca cromica attorno al nervo sciatico esposto a livello della regione mediale della coscia, al fine di creare una lesione da costrizione. Successivamente, si monitorano i comportamenti dolorosi nella zampa posteriore in intervalli di tempo prestabiliti, misurando in modo quantitativo la soglia di ritrazione della zampa a uno stimolo meccanico mediante un aestesimetro von Frey e la latenza di ritrazione della zampa a uno stimolo termico mediante un analgesimetro plantare.

I risultati finali possono dimostrare l'esistenza di dolore meccanico e termico, nonché l'ipersensibilità della zampa posteriore lesa, attraverso la misurazione delle risposte evocate di ritrazione a stimoli sia meccanici che termici. Questo metodo di lesione del nervo periferico, sviluppato inizialmente da Bene e Z, può aiutarci a rispondere a domande fondamentali nel campo del dolore cronico, come quali siano i meccanismi periferici e centrali attraverso cui insorge il dolore neuropatico. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del dolore neuropatico, poiché questo modello fornisce la base per esaminare nuove strategie finalizzate a ridurre l'ipersensibilità dolorosa.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché posizionare i punti di sutura gutturali cmic intorno al nervo statico e raggiungere un grado di tensione appropriato per causare un danno nervoso sufficiente ma non eccessivo è particolarmente complesso. Per iniziare questa procedura, disinfettare la superficie operatoria con etanolo al 70% e preparare gli strumenti sterili, le garze, le puntine e le compresse, che sono stati precedentemente autoclavati. Successivamente, anestetizzare il ratto in una camera di induzione utilizzando ISO fluorinico al 5%.

Somministrare il 2% di ISO fluorurato attraverso una maschera facciale su misura durante l'intervento chirurgico. Successivamente, depilare la zampa posteriore sinistra del ratto, quindi posizionare l'animale su un tappetino riscaldante a temperatura regolata a 37 gradi Celsius. Applicare un unguento oftalmico lubrificante sugli occhi.

Quindi preparare il filo di seta cromica tagliandolo in piccoli pezzi di circa tre centimetri e immergendoli in soluzione salina sterile. Successivamente, sterilizzare l'area rasata mediante tre applicazioni alternate di alcol e soluzione di iodio. Con l'animale in posizione prona, sollevare la zampa posteriore sinistra e mantenere il femore a 90 gradi rispetto alla colonna vertebrale utilizzando nastro adesivo sul piede.

Quindi effettuare un'incisione sulla pelle a circa tre-quattro millimetri al di sotto del femore. Separare la pelle dal muscolo circostante l'incisione tagliando il tessuto connettivo. Utilizzare un paio di forbici ottuse per tagliare il tessuto connettivo tra il muscolo gluteo superficiale e il muscolo bicipite femorale.

Successivamente, utilizzare un retrattore per allargare lo spazio tra i due muscoli, in modo da permettere una chiara visualizzazione del nervo sciatico; quindi, utilizzare pinzette e forbici microchirurgiche per liberare delicatamente circa 10 millimetri del nervo sciatico dal tessuto connettivo circostante. Posizionare il primo legaccio prossimale alla triforcazione del nervo sciatico per ciascun legaccio. Iniziare con un singolo laccio lento.

Quindi afferrare le due estremità vicino al cappio e tirare fino a quando il cappio è appena aderente e il legaccio non scivola lungo il nervo. Successivamente, mantenere il cappio nella sua posizione corretta e posizionare un secondo cappio sopra il primo per completare il nodo. Infine, tagliare le estremità libere del legaccio a circa un millimetro; la costrizione del nervo deve essere minima.

Ripetere i passaggi per le rimanenti tre legature, posizionando ciascuna legatura aggiuntiva un millimetro più in prossimalità rispetto alla precedente. Inoltre, alla fine dell'intervento chirurgico e con minima costrizione, utilizzare punti di sutura per chiudere lo strato muscolare e punti metallici per fissare la pelle. Successivamente, utilizzare una soluzione di iodio per sterilizzare la ferita.

Osservare attentamente l'animale durante il periodo di recupero dall'anestesia e permettergli di riprendersi in una gabbia separata con lettiera di carta piatta. Prima di iniziare l'esperimento, manipolare l'animale quotidianamente per diversi giorni.

Successivamente, prima del test comportamentale, abituare il ratto all'ambiente dell'involucro. L'ambiente di prova deve essere mantenuto silenzioso e ben controllato, con temperatura e umidità costanti, e ogni sessione di prova deve essere eseguita in un orario simile della giornata. Per studiare la soglia meccanica di ritrazione nel giorno del test, posizionare il ratto nella gabbia di prova con pavimento a rete rialzato, da 15 a 30 minuti prima dell'esperimento; utilizzando un dinamometro plantare von Frey in posizione anteriore, posizionare l'unità stimolatrice tattile con il filamento direttamente al di sotto della superficie plantare mediale della zampa posteriore e premere il tasto di avvio.

Questo solleva il filamento per stimolare meccanicamente la superficie plantare della zampa posteriore con una forza crescente. Successivamente, registrare la soglia meccanica di ritrazione da entrambe le zampe posteriori, lesa e non lesa. Questo dispositivo registra e visualizza automaticamente il valore massimo applicato in corrispondenza della reazione di ritrazione.

Ripetere la stimolazione meccanica tre volte con un intervallo di circa cinque minuti tra uno stimolo e l'altro, testando gli artigli posteriori non lesi in ordine controbilanciato, quindi calcolare la media delle soglie di ritrazione dell'arto. Per studiare la latenza alla ritrazione termica nel giorno del test, posizionare il ratto sul pavimento di vetro. Introdurre il ratto nella gabbia di test da 15 a 30 minuti prima dell'esperimento; utilizzando uno strumento termico per l'analgesia plantare, posizionare la sorgente infrarossa direttamente al di sotto della superficie plantare mediale dell'arto posteriore e premere il tasto di avvio.

Questo espone la superficie plantare della zampa posteriore a un fascio di calore radiante attraverso una superficie di vetro trasparente. Registrare quindi la latenza del ritiro sia dalla zampa posteriore lesionata che da quella non lesionata. Questo dispositivo registra automaticamente il tempo trascorso dall'inizio dello stimolo termico al ritiro della zampa dalla fonte di calore.

Ripetere la stimolazione termica almeno tre volte con un intervallo di circa cinque minuti tra uno stimolo e l'altro, testando in ordine controbilanciato le zampe posteriori lesionate e non lesionate, quindi calcolare la media delle latenze di ritrazione della zampa. Qui viene mostrata la soglia di ritrazione meccanica in entrambe le zampe, lesionate e non lesionate, di ratti Wistar prima e fino a 12 giorni dopo la costrizione cronica del nervo sciatico. Si osserva una riduzione significativa della soglia di ritrazione della zampa posteriore ipsilaterale lesionata rispetto alla zampa controlaterale non lesionata in risposta a stimoli meccanici. Riportata qui è la latenza termica di ritrazione in entrambe le zampe, lesionate e non lesionate, prima e fino a 12 giorni dopo la costrizione cronica del nervo sciatico.

Allo stesso modo, la latenza al ritiro termico è significativamente ridotta nella zampa posteriore omolaterale lesa rispetto alla zampa posteriore controlaterale non lesa. Una volta padroneggiata, la chirurgia CCI può essere eseguita correttamente in appena 20 minuti per animale, provocando una ipersensibilità al dolore a lungo termine della zampa posteriore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di annodare le ligature in modo lento, poiché è l'autostrangolamento al di sotto delle ligature a seguito dell'edema a causare la costrizione dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica di lesione del nervo periferico combinata con il test dell'ipersensibilità al dolore all'onda P offre ai ricercatori nel campo del dolore neuropatico un metodo per esplorare i meccanismi alla base del dolore cronico causato da lesione nervosa.