Le risposte di imaging neuronale in preparazione Fetta di organo vomeronasale Esprimere un sensore di calcio geneticamente codificato

L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare come preparare sezioni di tessuto vivente per l'acquisizione di immagini delle risposte ai feromoni nei neuroni dell'organo nasale MRO. Questo viene realizzato innanzitutto preparando sezioni di tessuto vivente dell'organo nasale MRO o dell'organo vomeronasale (VNO) da topi che esprimono un indicatore genetico del calcio, GCaMP2. Il passaggio successivo consiste nell'allestire il sistema di perfusione sul tavolo del microscopio per mantenere la sezione, applicare lo stimolo e acquisire le immagini.

La risposta. Viene quindi eseguito un esperimento di imaging in time-lapse con diversi stimoli feromonici, seguito dall'analisi dei dati dei risultati di imaging. In definitiva, si ottengono i pattern di risposta dei neuroni del VNO a diversi stimoli feromonici.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il carico di calcio D o l'imaging in cellule dissociate, è che possiamo preservare la morfologia integra delle cellule, mantenere meglio lo stato di salute delle sezioni e ottenere un segnale più intenso. Questo metodo può aiutarci a rispondere ad alcune delle domande fondamentali nello studio del sistema olfattivo del verme, come l'identificazione dei ligandi e dei loro recettori e il profilo delle risposte dei singoli neuroni nasali del verme. Questo metodo può essere applicato anche ad altri sistemi, come quelli olfattivo, sierico o cerebrale.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà a causa della complessità nel reperire un buon campione di psoriasi e nel configurare il sistema di perfusione. Prima di iniziare questa procedura, preparare le soluzioni necessarie, inclusa la soluzione ringer di liquido cerebrospinale artificiale per topo, agarosio a basso punto di fusione al 4% e stimoli feromonali, seguendo il manoscritto allegato. Successivamente, posizionare due provette di agarosio a basso punto di fusione su un blocco riscaldante.

Impostare la temperatura a oltre 60 gradi Celsius per sciogliere gli aros. Una volta che il gel si è liquefatto, trasferire le provette in un blocco termocondizionato a 37 gradi Celsius. Per preparare le sezioni del VNO.

Dopo aver decapitato un topo eutanasizzato che esprime GCaMP2, tagliare le ossa della mandibola con un paio di forbici per rimuovere la mascella inferiore. Successivamente, staccare il tessuto rugoso del palato superiore per esporre la cavità nasale. Quindi, separare le ossa della mascella inserendo una lama chirurgica tra i due incisivi anteriori.

Rimuovere con attenzione l'osso mascellare per esporre l'organo vomeronasale. A questo punto, sollevare l'intero organo vomeronasale dalla cavità nasale tenendolo per la coda. Trasferire l'organo vomeronasale nella soluzione di liquido cefalorachidiano per topo, ossigenata e fredda.

Immediatamente sotto la lente di dissezione, separare i due VNO facendo scivolare delicatamente le punte della pinzetta lungo la parete dell'osso settale. Staccare l'osso vulner che racchiude il tessuto del VNO. Quindi sollevare delicatamente l'intero tessuto del VI NO dalla cavità ossea.

Bisogna prestare la massima attenzione in questo passaggio per evitare di danneggiare l'epitelio neuroectodermico. Successivamente, rimuovere completamente i piccoli frammenti ossei rimasti sulla superficie del tessuto. Prima di incorporare i frammenti rimasti.

Il tessuto potrebbe essere agganciato dalla lama di taglio, il che causerebbe l'estrazione del tessuto dal blocco di aros. Successivamente, utilizzare la pinzetta per tenere l'estremità posteriore del tessuto del VNO ed immergerlo delicatamente nell'aros fuso. Raffreddare rapidamente il tubo sul ghiaccio.

Per solidificare l'agarosio, il processo di inclusione e raffreddamento deve richiedere meno di due minuti. Successivamente, tagliare il blocco di agarosio contenente l'organo vomeronasale e incollarlo al supporto per tessuti. Inserire quindi il supporto nel cilindro metallico e riempire la cavità rimanente con ulteriore agarosio a basso punto di fusione.

Una volta che l'agarosio a basso punto di fusione si è solidificato sul ghiaccio, procedere immediatamente al taglio, fornendo al comparto di sezione del tagliacampione un liquido cefalorachidiano (CSF) murino ossigenato e freddo, e tagliare le sezioni con uno spessore compreso tra 180 e 200 micron ciascuna. Successivamente, raccogliere e trasferire le sezioni nel comparto di incubazione. I preparati rimangono vitali per sei-otto ore nel liquido CSF murino ossigenato a temperatura ambiente.

In questo procedimento, posizionare innanzitutto una sezione del VNO al centro della camera di perfusione e fissare la sezione con un ancoraggio per tessuti. I fili dell'ancoraggio devono premere soltanto sulla parte della sezione costituita dall'agarosio a basso punto di fusione, ma non sul tessuto del VNO. Successivamente, inviare il liquido cerebrospinale A di topo ossigenato nella camera di perfusione attraverso il porto di ingresso a una velocità di circa 100 microlitri al secondo.

Il liquido viene drenato attraverso un ago a vuoto tramite il porto di uscita per garantire un flusso continuo di liquido cefalorachidiano fresco di topo. Successivamente, riempire una siringa da 30 millilitri con soluzione di Ringer e fissarla alla pompa per siringa. Impostare la velocità della pompa da 300 a 600 microlitri al minuto.

Per garantire un flusso continuo di soluzione Ringer sulla sezione, collegare l'uscita della soluzione Ringer al loop di iniezione A-H-P-L-C. Il controllo del loop di iniezione presenta due percorsi di flusso. In posizione di caricamento, caricare il campione di urina di topo nel loop del campione utilizzando una siringa di precisione Hamilton.

Il campione in eccesso esce dal loop del campione attraverso l'uscita per gli scarti. La soluzione di Ringer iniettata dalla pompa a siringa bypassa il loop del campione e va direttamente all'uscita, che è collegata alla punta di perfusione nella posizione di iniezione. La soluzione della pompa scorre attraverso il loop del campione e spinge gli stimoli feromonici verso l'uscita.

Prima dell'esperimento di imaging, rimuovere le bolle d'aria per garantire un flusso uniforme del fluido di perfusione. Successivamente, regolare la punta di perfusione sotto un obiettivo 5x o 10x in modo che la punta si trovi a circa un millimetro dalla fetta di vien O.

Per misurare il tempo di ritardo del campione e la durata, caricare nel loop del campione 0,1% di colorante rho domine six G fluorescente. Successivamente, commutare la valvola sulla posizione di iniezione. Cinque secondi dopo l'inizio dell'acquisizione delle immagini, rilevare il segnale fluorescente tra 10 e 30 secondi.

La curva regolare del segnale fluorescente indica anche che vi è poca turbolenza generata sotto l'obiettivo immerso e che un'adeguata perfusione di liquido cefalorachidiano ossigenato del topo raggiunge la sezione nel nostro laboratorio. Per l'acquisizione di immagini in time-lapse finalizzata al rilevamento dei segnali GAMP due, si utilizza il microscopio Zeiss Axio Scope FS due equipaggiato con un obiettivo ad immersione in acqua 10x o 20x. Viene impiegato il filtro standard a banda passante GFP compreso tra 450 e 490 nanometri.

Le immagini epifluorescenti vengono acquisite mediante una telecamera CCD con uno spinning uno per uno o due per due, a seconda dei livelli di espressione di GCaMP due. Impostare innanzitutto la velocità di acquisizione a un fotogramma al secondo. Regolare l'intensità della luce per minimizzare lo sbiancamento dei segnali di GCaMP due e i danni fotoindotti alle cellule.

Quindi, passare la valvola alla posizione di iniezione in un punto temporale specifico, in modo da ottenere ritardi temporali costanti in tutte le prove all'interno di un insieme di esperimenti. Eseguire ora una prova preliminare utilizzando la soluzione di Ringer come stimolo, e riassestare il sistema di perfusione se si verifica un artefatto di movimento durante l'iniezione del campione. Successivamente, eseguire una prova di controllo positivo con l'urina di topo diluita uno a 100 nella soluzione, al fine di prevenire contaminazioni incrociate tra campioni diversi.

Lavare la siringa di Hamilton con soluzione di Ringer almeno tre volte dopo il caricamento di uno stimolo. Analogamente, lavare il loop campione con soluzione di Ringer almeno tre volte tra stimoli diversi prima dell'applicazione. Attendere dal quattro ai dieci minuti prima dello stimolo successivo, in modo che i neuroni sensoriali nasali MRO si riprendano, per eseguire la registrazione delle immagini di tutte le immagini acquisite da una singola sezione.

Uno script VBA scritto su misura in Avision viene utilizzato per automatizzare questo processo. In questo caso, tutti i fotogrammi dell'immagine all'interno dello stesso esperimento vengono registrati rispetto a un fotogramma di riferimento comune scelto, con elasticità, per eseguire la sottrazione delle immagini al fine di identificare le cellule responsivi. Le macro scritte su misura in ImageJ versione 1.42 vengono utilizzate per automatizzare questo processo.

Viene generata un'immagine di proiezione minima per ogni stack e le cellule rispondenti emergono dopo che la proiezione minima è stata sottratta dagli stack grezzi. Successivamente, identificare la regione di interesse dagli stack sottratti e ottenere le coordinate della ROI utilizzando il plugin multi mesure di ImageJ. Quindi, elaborare tutti gli stack di un esperimento e salvare tutte le coordinate della ROI in un elenco master di ROI. Dopodiché, utilizzare l'elenco master di ROI per misurare le risposte cellulari dagli stack di immagini grezze mediante un macro appositamente scritto e il plugin multi mesure di ImageJ. Infine, tracciare le curve di risposta e la mappa termica in Matlab.

Qui viene mostrato un esempio dell'esperimento di imaging del VNO utilizzando campioni di urina raccolti da quattro topi singoli. Circa 80 cellule mostrano una risposta ad almeno uno degli stimoli urinari e i loro valori di risposta delta F diviso F sono riportati nella mappa termica. Di seguito sono riportati i tracciati di risposta delle cellule uno, due e tre, che mostrano l'attivazione nel tempo in risposta agli stimoli urinari: la cellula uno mostra risposta a entrambi i campioni di urina femminile, ma non ai campioni maschili.

Mentre la cellula due mostra schemi di attivazione opposti e risponde a entrambi i campioni maschili. Solo la cellula tre viene attivata sia dai campioni maschili che femminili. Una volta preparato, il taglio può essere eseguito in 30 minuti e i neuroni piano possono essere mantenuti in vita per sei-otto ore se l'operazione viene eseguita correttamente.

Nel tentativo di applicare questo metodo, è importante ricordare di utilizzare reagenti di grado istoculturale e di evitare reagenti per la fissazione dei tessuti a contatto con i preparati tessutali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare tessuti vivi di psoriasi per l’imaging delle risposte termiche nei neuroni di Vienna utilizzando topi esprimenti G Camp.