Stretching brevi sequenze di DNA con pinzette costante forza assiale ottici
13 ottobre 2011
Illustriamo l'uso di una forza costante pinzette ottiche assiali per esplorare le proprietà meccaniche delle molecole di DNA brevi. Con stiramento DNA assialmente, riduciamo al minimo gli ostacoli sterici e manufatti derivanti convenzionale manipolazione laterale, che ci permette di studiare molecole di DNA più corto ~ 100 nm.
L'obiettivo generale di questa procedura è manipolare molecole di DNA corte di 100 nanometri di lunghezza mediante forze ottiche costanti e ben calibrate. Questo risultato si ottiene ancorando un'estremità del DNA a un coprioggetto e l'altra a una microsfera di polistirene. Successivamente, le pinzette ottiche vengono allineate e calibrate.
Successivamente, il DNA viene allungato lontano dalla superficie mediante una combinazione di forze gradiente e forze di scattering che agiscono sulla microsfera. Infine, il DNA viene esteso intrappolando la perlina nella regione lineare del potenziale. Il protocollo è stato utilizzato per studiare le proprietà meccaniche del DNA e la cinetica del legame tra DNA e proteine, ed è stato inoltre utile per chiarire l'importanza delle condizioni al contorno sull'elasticità di costrutti di DNA corti.
Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà poiché l'allineamento e la calibrazione delle pinzette ottiche a forza costante sono operazioni difficili e complesse. Le pinzette ottiche comprendono un fascio proveniente da un laser a 1064 nanometri che viene suddiviso in due fasci polarizzati ortogonalmente. Uno viene utilizzato per manipolare la biomolecola, mentre l'altro è destinato alle operazioni di calibrazione.
L'intensità del fascio di manipolazione è controllata da un deflettore ottico acousto-ottico (AO) o da un OD. I fasci vengono quindi ricombinati mediante un altro divisore di fascio polarizzante. I fasci sono focalizzati con precisione da un obiettivo microscopico a immersione in olio plan-apocromatico da 60x, apertura numerica 1,4, sul campione cellulare. Questo sistema di pinzette ottiche è abbinato a un microscopio in campo chiaro costruito in laboratorio, che fornisce illuminazione proveniente da una lampada alogena focalizzata sulla camera del campione tramite un condensatore.
L'immagine in campo chiaro viene separata dalla luce laser mediante uno specchio dicromatico e successivamente proiettata su due telecamere CCD. Una delle telecamere CCD funge da mezzo principale per l'acquisizione dei dati ed è attivata via software per ottenere frequenze di campionamento precise. L'altra telecamera CCD viene utilizzata per acquisire l'immagine di una singola microsfera di riferimento immobilizzata, la cui posizione funge da sistema di controllo in retroazione per compensare le deriva del microscopio.
Il campione viene posizionato in modo approssimativo rispetto all'obiettivo mediante uno stadio XY e successivamente può essere posizionato con precisione tramite uno stadio piso tridimensionale integrato. La luce laser diffusa in avanti e trasmessa viene raccolta dal condensatore a campo chiaro e focalizzata su un fotodetettore per calibrare le dimensioni della perla, caricare una camera per campioni con una soluzione dispersa di microsfere di polistirene di diametro 800 nanometri diluite in soluzione salina tamponata al fosfato. Lasciare riposare per 10-15 minuti, quindi risciacquare delicatamente con tampone.
Per rimuovere le microsfere in eccesso, individuare una microsfera attaccata casualmente al vetrino coprioggetto e regolare l'altezza della camera del campione finché la microsfera non si trova approssimativamente a un micrometro al di sotto del fuoco. Per generare un'immagine defocalizzata e misurare la dimensione apparente dell'immagine utilizzando LabVIEW, innanzitutto trovare il centro della microsfera mediante la funzione di corrispondenza del modello geometrico. Successivamente, generare un profilo radiale dell'intensità della microsfera effettuando la media su 360 gradi.
Al centro di ogni sezione trasversale, adattare il profilo radiale, che corrisponde a un anello bianco in ciascuna delle immagini in campo chiaro, mediante una funzione quadratica. Per individuare un picco di luminosità, la distanza tra questo picco e il centro può essere utilizzata come misura della dimensione apparente della perla, utilizzando lo stage calibrato per aumentare gradualmente la posizione assiale della microsfera e acquisire un'immagine a ciascuna posizione assiale mediante la telecamera CCD. Ripetere l'analisi delle immagini per ciascuna immagine successiva al fine di correlare la dimensione apparente della microsfera con la sua posizione assiale.
La risoluzione assiale ottenuta con questo metodo è di circa 1,4 nanometri per mappare il potenziale ottico del fascio di manipolazione. Iniziare con la collinazione, allineando il fascio di manipolazione e il fascio di calibrazione con il fascio di manipolazione spento. Confinare una microsfera libera all'interno della trappola molto più rigida del fascio di calibrazione. Ora accendere il fascio di manipolazione.
Poiché è molto più debole del fascio di calibrazione, la posizione assiale della microsfera sarà leggermente perturbata. La variazione risultante nella posizione assiale può essere misurata a partire dalle immagini in campo chiaro defocalizzate, come già descritto. Spostare il fuoco assiale e ripetere, riportando in grafico lo spostamento delta X in funzione della posizione assiale del fuoco del fascio di calibrazione.
La posizione assiale corrispondente allo spostamento massimo della microsfera determina il centro della regione lineare della trappola ottica. Per stirare un campione di DNA, montare la camera contenente le molecole di DNA ancorate alla superficie e, osservando l'immagine in campo chiaro, posizionare il fuoco del fascio di manipolazione leggermente al di sopra delle microsfere non stirate regolando il telescopio; quindi regolare la posizione dello stadio finché una delle microsfere non viene intrappolata. Posizionare approssimativamente la microsfera al centro del piano XY della trappola ottica, generare una serie di onde quadre in LabVIEW e inviarle all'A OD per accendere e spegnere ripetutamente il fascio laser.
Osservare il microsfera mentre il trappolamento viene attivato e disattivato ripetutamente. Verificare se il laser induce una direzione preferenziale al movimento della microsfera mentre si regola iterativamente la posizione della microsfera sia nella direzione X che in quella y. Controllando il palco piso, il moto casuale della microsfera dovrebbe diventare isotropo nel piano X y, sebbene risulti chiaramente limitato quando il laser è acceso.
Successivamente, allineare la perla nella direzione Z. Pulsare nuovamente il fascio laser attivandolo e disattivandolo, misurando questa volta contemporaneamente lo spostamento assiale delle microsfere in tempo reale.
Centrare la piattaforma nella regione lineare, ovvero il punto in cui lo spostamento in Z è massimo per allungare la rampa di DNA, regolando l'intensità del laser inviando un segnale di tensione al deflettore acusto (AOD) da zero volt a 0,5 volt a passi di 0,025 volt. Registrare 400 fotogrammi a 100 fotogrammi al secondo e mediare i valori ottenuti per determinare lo spostamento assiale. Infine, tracciare le curve forza-allungamento e adattarle a un modello di catena elicoidale modificato.
Qui sono mostrate curve forza-allungamento per sequenze di NA 2D, lunghe 1 e 298 paia di basi e 247 paia di basi, per brevi tratti di DNA. Il modello convenzionale a catena worm-like (WLC) non spiega completamente la relazione tra forza e allungamento poiché, a queste scale di lunghezza, è necessario tenere conto degli effetti di dimensione finita e dell'allungamento a forza nulla derivante dai vincoli al contorno. Le misurazioni della relazione forza-allungamento devono quindi essere adattate utilizzando un modello WLC modificato, che prevede una lunghezza di persistenza efficace e un allungamento a forza nulla come parametri di adattamento descritti ulteriormente nei materiali supplementari.
Per lunghezze di contorno elevate di D-S-D-N-A, la lunghezza di persistenza efficace corrisponde semplicemente alla lunghezza di persistenza nominale di circa 50 nanometri, e l'estensione a forza nulla può essere trascurata negli adattamenti della WLC modificata. Le lunghezze di persistenza efficaci sono di 35 nanometri per il DNA di 1.298 paia di basi e di 25 nanometri per il DNA di 247 paia di basi dopo il suo sviluppo. Questo metodo ha aperto la strada a una serie di misurazioni nanomeccaniche su DNA e complessi DNA-proteina, inclusi studi sulla cinetica della formazione e del disfacimento di loop nel DNA mediati da proteine regolatorie.
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Panoramica
Questo studio dimostra l'uso di pinze ottiche assiali a forza costante per analizzare le proprietà meccaniche di molecole di DNA corte. Allungando assialmente il DNA, il metodo minimizza gli ingombri sterici, permettendo l'analisi di DNA lungo circa 100 nm.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biophysica
- Biologia Molecolare
- Manipolazione Ottica
Sfondo
- Le molecole di DNA corte presentano sfide uniche negli studi meccanici.
- La manipolazione laterale convenzionale può introdurre artefatti.
- Comprendere la meccanica del DNA è fondamentale per varie applicazioni biologiche.
- Le pinzette ottiche offrono un metodo non invasivo per la manipolazione.
Scopo dello studio
- Manipolare molecole di DNA corte utilizzando forze ottiche calibrate.
- Studiare le proprietà meccaniche del DNA e le sue interazioni.
- Chiarire gli effetti delle condizioni al contorno sull'elasticità del DNA.
Metodi Utilizzati
- Legare il DNA a una lamella e a una microsfera di polistirene.
- Allineare e calibrare le pinzette ottiche.
- Stirare il DNA utilizzando forze di gradiente e di scattering.
- Imprigionare la sferetta nella regione lineare del potenziale per l'allungamento.
Risultati principali
- Manipolazione con successo di molecole di DNA lunghe anche 100 nm.
- Informazioni sulle proprietà meccaniche del DNA e sulla cinetica di legame delle proteine.
- Dimostrata l'importanza delle condizioni al contorno sull'elasticità.
- Convalidato l'uso delle pinzette ottiche per lo studio della meccanica del DNA.
Conclusioni
- Il metodo riduce efficacemente gli artefatti nella manipolazione del DNA.
- I pinzette ottiche sono uno strumento potente per studi biofisici.
- I risultati contribuiscono a una comprensione più approfondita della meccanica del DNA.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Lo studio delle proprietà meccaniche di costrutti di DNA brevi è fondamentale per comprendere le interazioni proteina-DNA e la dinamica della cromatina nella validazione iniziale delle proteine bersaglio. I pinzette ottiche assiali a forza costante consentono una manipolazione precisa di DNA sub-chilobase, riducendo gli artefatti sperimentali dovuti a ingombro sterico e torsione. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistico fornendo dati quantitativi e riproducibili sull'elasticità del DNA e sulla cinetica di legame sotto forze controllate.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche misurando la meccanica del DNA dipendente dalla forza a lunghezze fisiologicamente rilevanti.
- Valore operativo: Fornisce un rilevamento in tempo reale, senza etichette, della cinetica di legame proteico e dei cambiamenti conformazionali.
- Valore predittivo: Sostiene la fiducia sul bersaglio chiarificando come le condizioni al contorno influenzino l'elasticità del DNA nei complessi nucleoproteici.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Genera curve forza-allungamento standardizzate adatte a confronti ad alta fedeltà tra diversi costrutti di DNA.
- Riproducibilità: Utilizza un posizionamento della piattaforma controllato da retroazione per compensare le deriva, consentendo misurazioni precise e ripetibili nel tempo.
- Scalabilità: La trappola ottica lineare si estende assialmente per circa 350 nm, permettendo cicli ripetuti di allungamento senza necessità di ricalibrazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega la biofisica della fase di scoperta con modelli preclinici definendo i parametri meccanici delle interazioni DNA-proteina.
- De-risking meccanicistico: Chiarisce come gli effetti della lunghezza ridotta del DNA alterino la cinetica di legame, fornendo indicazioni per l'ottimizzazione dei composti leader nei bersagli di regolazione genica.
- Conferma predittiva: L'adattamento del modello della catena worm-like modificato tiene conto degli effetti di dimensione finita, migliorando l'estrapolazione a contesti genomici più lunghi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto guida, in particolare per bersagli che coinvolgono proteine leganti il DNA o modulatori della cromatina.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici quantificando come i vincoli meccanici influenzino il legame di fattori di trascrizione o di istoni.
- Screening: Permette la prontezza del saggio grazie alla capacità di blocco forzato e al monitoraggio in tempo reale dello spostamento assiale mediante retroazione di una microsfera di riferimento.
- Analisi: Fornisce dati quantitativi sulla forza in funzione dell'estensione e stime della lunghezza di persistenza per l'analisi comparativa tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validità preclinica stabilendo parametri biophysici di riferimento per l'elasticità del DNA in sistemi rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: La configurazione dei pinzette assiali funge da piattaforma riutilizzabile per diversi bersagli di acidi nucleici e proteine dopo la calibrazione iniziale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella meccanica del DNA isolando l'applicazione della forza assiale e minimizzando gli artefatti rotazionali.
- Valore operativo: Garantisce stabilità della forza e compensazione della deriva mediante il trappolamento ottico in una regione di potenziale lineare e retroazione dello stage.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di tipo go/no-go nella validazione degli obiettivi fornendo evidenze biofisiche dell'interazione con il bersaglio sotto forze definite.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati mirati al DNA in base alla stabilità meccanica e alla cinetica di legame validate, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allineamento della trappola ottica, nella calibrazione e nel controllo della retroazione del palco piezoelettrico.
- È necessario un sistema laser a 1064 nm con deflettore acusto-ottico, suddivisione del fascio polarizzato e obiettivo ad immersione in olio con alta apertura numerica.
- Richiede standardizzazione tra i gruppi di lavoro per la calibrazione delle dimensioni delle perline, la correzione della deriva e l'esecuzione del protocollo forza-allungamento.
- Deve tenere conto degli effetti sterici e delle condizioni al contorno nell'interpretazione dei dati ottenuti da costrutti di DNA di dimensioni inferiori a 500 pa.
- Limitato alle forze per cui la trappola ottica rimane nella regione lineare; al di fuori di questo intervallo, sono necessarie regolazioni del feedback o del modello.
