Selezione e isolamento di colonie di cellule pluripotenti indotte umane staminali riprogrammato da fibroblasti adulti

In questo articolo video, i fibroblasti adulti umani vengono riprogrammati per generare cellule staminali pluripotenti utilizzando vettori retrovirali. In primo luogo, i fibroblasti umani vengono trasdotti con vettori retrovirali che codificano per i fattori di trascrizione. T tre quattro, SOX due, KLF quattro e cmic.

I fibroblasti infetti vengono coltivati su cellule di alimentazione embrionali di topo per 14-28 giorni. Le colture risultanti vengono colorate con l'anticorpo TRA 180 1 per identificare colonie di cellule riprogrammate. Le colonie positive vengono quindi trasferite in piastre contenenti MEF per l'espansione.

La colorazione immunocitochimica conferma l'espressione di marcatori di pluripotenza e la creazione di linee cellulari staminali pluripotenti. Dovrebbero quindi essere eseguiti ulteriori studi per caratterizzare ulteriormente le linee. Generalmente gli individui che non conoscono la programmazione delle cellule somatiche e le colture di cellule staminali pluripotenti indotte umane avranno difficoltà perché è difficile identificare le colonie IPSC corrette.

A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Sula Pollak post-Doctor O Fellow del mio laboratorio. Iniziare questa procedura placcando le cellule Phoenix AM FO a una densità di circa sette-8 milioni di cellule per piastra da 10 centimetri in 10 millilitri di DMEM ad alto contenuto di glucosio posto nell'incubatore e nella coltura durante la notte. Il giorno successivo preparare miscele di trasfezione costituite da 12 microgrammi di un vettore codificante per T tre quattro SOX, due klf, quattro cmic o gene GFP e 35 microlitri pochi gene sei in un volume totale di 500 microlitri di siero libero ad alto glucosio DMEM con L-glutammina.

Incubare le miscele per 20 minuti. Quindi, per trasfettare le cellule della fenice, pipettare delicatamente i complessi di DNA nelle piastre contenenti cellule della fenice, che dovrebbero essere confluenti al 70-80%. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi dopo sei-otto ore.

Aspirare il terreno e sostituirlo con otto millilitri di DMEM ad alto contenuto di glucosio con antibiotici. Quindi rimettere le piastre nell'incubatore per 12 ore dopo l'incubazione. Utilizzare una pipetta per aspirare e raccogliere il terreno contenente il virus.

Quindi sostituire il terreno e ripetere questo processo ogni 12 ore fino a quando il terreno non è stato raccolto quattro volte. Conservare il terreno a quattro gradi centigradi. Una volta raccolto tutto il terreno, unire tutte le porzioni, quindi versarlo attraverso un filtro superiore da 0,45 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri per rimuovere cellule staccate e detriti.

Il mezzo filtrato, che contiene particelle virali, può essere conservato in frigorifero per due settimane senza perdere l'attività infettiva. Il congelamento non è raccomandato. Il giorno prima della procedura di trasduzione, scongelare il ceppo congelato di fibroblasti umani adulti e aggiungere una volta 10 alla quinta cellula per ogni pozzetto di piastre rivestite di gelatina a sei pozzetti.

Il giorno successivo in una provetta conica da 50 millilitri, combinare 3,5 millilitri ciascuno di T quattro SOX due, klf quattro e mezzo virale cmic e aggiungere poly brain a una concentrazione finale di sei microgrammi per litro come controllo. Preparare un millilitro di terreno virale GFP, tre millilitri di coltura, terreno e poli cervello a una concentrazione finale di sei microgrammi per millilitro. Aspirare il terreno dalla piastra contenente fibroblasti umani.

Quindi aggiungere quattro millilitri di terreno virale misto o di terreno di controllo, centrifugare le piastre a 1600 G per un'ora a 20 gradi centigradi dopo la centrifugazione. Incubare le piastre per circa 12 ore. Quindi sostituire il terreno virale con un terreno di coltura per fibroblasti e incubare per altre 12 ore.

Ripetere questo processo dall'infezione alla coltura in terreno fibroblastico, altre due volte dopo l'ultima infezione. Coltura dei fibroblasti in DMEM per 48 ore. Quindi verificare l'efficienza dell'infezione delle trasduzioni parallele con il terreno retrovirale GFP.

Successivamente avviare la riprogrammazione da cellule somatiche a cellule pluripotenti. I fibroblasti infetti vengono coltivati in terreno di cellule staminali embrionali umane o in semi di topo HES, fibroblasti o MEF ad una densità di circa due volte 10 al quinto delle cellule per pozzetto della gelatina trattata. Piastra a sei pozzetti nel terreno di crescita dei fibroblasti il giorno successivo.

Scindere i fibroblasti umani infetti utilizzando lo 0,05% di tripsina EDTA e seminarli alla densità di circa 1,2 volte 10 al quarto pozzetto nel terreno di crescita dei fibroblasti. Il giorno dopo. Sostituire il terreno con un terreno HES contenente 0,5 millimolari di butirrato di sodio per i primi sette giorni della riprogrammazione.

Cambia il mezzo ogni giorno. Sostituire i terreni con terreni HES senza butirrato di sodio e continuare la riprogrammazione per altri sette-21 giorni. Cambia il mezzo ogni giorno ogni giorno.

Controllare le cellule trasdotte per i cambiamenti morfologici. Le colonie di cellule inizieranno ad emergere circa 10 giorni dopo il trasferimento dei fibroblasti trasdotti sulle cellule alimentatrici. Le colonie contenenti le cellule riprogrammate sono ora indicate come cellule staminali pluripotenti indotte umane o cellule IPS umane.

Le colonie di cellule IPS umane saranno pronte per essere isolate in 14-28 giorni dopo averle piastrate sulle cellule di alimentazione MEF. In questa fase, le colonie di cellule IPS umane possono essere trasferite su piastre contenenti MEF o ricoperte di matrigel. Il trasferimento sulle piastre contenenti MEF viene dimostrato un giorno prima del prelievo delle colonie di cellule IPS umane Seminare piastre a 24 pozzetti contenenti cellule feeder MEF irradiate con raggi gamma in terreno di crescita dei fibroblasti.

Incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 il giorno in cui verranno raccolte le colonie di cellule IPS umane. Aspirare il terreno di coltura dei fibroblasti dai ME Fs e sciacquarli con PBS per rimuovere eventuali tracce di FBS. Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri di cellule staminali embrionali umane o terreno HES contenente 10 inibitori di rocce micromolari Y 2 7 6 3 2 a ciascun pozzetto Successivamente, utilizzando un microscopio montato in una cappa a flusso laminare, esaminare le piastre di riprogrammazione per la formazione della colonia di cellule IPS umane.

Se necessario, rimuovere i fibroblasti che circondano le colonie di cellule IPS umane con un ago calibro 21. Sciacquare le piastre con PBS e aggiungere un terreno HES fresco contenente l'anticorpo specifico TRA 180 1 stain alive. Rimettere le cellule nell'incubatore a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.

Dopo 30 minuti, sostituire il terreno con un terreno HES fresco integrato con 10 inibitori micromolari di roccia. Quindi osserva le colonie al microscopio a fluorescenza. Contrassegnare TRA da uno a 81 colonie positive.

Utilizzando un marcatore obiettivo utilizzando un ago calibro 21. Tagliare le colonie di cellule IPS umane TRA 180 1 positive in diversi piccoli pezzi. Successivamente, utilizzando una pipetta automatica, trasferire frammenti di colonie di cellule IPS umane nei singoli pozzetti della piastra a 24 pozzetti con ME Fs.Evitare di trasferire cellule non IPS.

Posizionare le piastre nell'incubatrice e lasciare che le colonie di cellule IPS umane si attacchino per 24-36 ore cambiando terreno ogni giorno. Le colonie di cellule IPS umane con una corretta morfologia simile all'HE saranno visibili 48 ore dopo il trasferimento iniziale su una piastra a 24 pozzetti, passando manualmente le colonie di cellule IPS umane ogni sei-otto giorni, tagliandole con una placca ago calibro 21. Espansione delle colture su una piastra a 12 pozzetti e successivamente su una piastra a sei pozzetti dopo l'espansione clonale.

E stabilire le linee cellulari IPS umane analizzare l'espressione dei marcatori di pluripotenza TRA uno, 60, SSEA quattro, T tre, quattro, SOX due e nanog utilizzando l'immunochimica una volta che le linee sono state stabilite. La caratterizzazione dettagliata può comportare in vitro e in vivo. Analisi di differenziazione, analisi del cariotipo, analisi di studi di metilazione con silenziamento transgenico e studi di espressione genica.

Una trasduzione efficiente con terreno contenente retrovirus è fondamentale per una riprogrammazione di successo per determinare l'efficacia della trasduzione virale. I fibroblasti adulti umani derivati da un paziente con atassia di Friedrichs sono stati visualizzati dopo due infezioni consecutive con terreno retrovirale GFP quando i fibroblasti sono stati infettati mediante semplice incubazione con mezzo virale, meno del 20% delle cellule è stato trasdotto. Tuttavia, quando l'aggiunta del terreno retrovirale GFP è stata immediatamente seguita, l'efficienza della trasduzione è aumentata notevolmente.

Qui più dell'80% delle cellule viene trasdotto per condurre una caratterizzazione iniziale delle colonie di cellule IPS umane isolate. L'espressione dei marcatori di pluripotenza caratteristici delle cellule ES umane è stata valutata mediante immunochimica come mostrato qui. Le colonie di cellule IPS umane isolate erano positive per i marcatori di pluripotenza.

T tre quattro SOX due nano SSEA quattro e TRA uno 60 DNA. La colorazione di Cos con DPI mostrata sui pannelli superiori è rilevata sia nelle colonie di cellule IPS umane che nelle cellule di alimentazione. Questi risultati dimostrano che le cellule IPS umane ottenute utilizzando questo protocollo di riprogrammazione esprimono marcatori di pluripotenza appropriati caratteristici delle cellule staminali pluripotenti umane indifferenziate.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come riprogrammare con successo i fibroblasti umani in cellule staminali pluripotenti utilizzando la transazione retrovirale identificata correttamente indurre umano, colonie di cellule staminali pluripotenti e condurre la caratterizzazione iniziale dei PC HI.