Rilevazione diretta della acetato di formazione Attività di acetato enzima chinasi

Questo esperimento mira a misurare direttamente l'attività di formazione dell'acetato chinasi. Avviare la reazione aggiungendo l'enzima a una miscela di reazione contenente l'acetil fosfato e un substrato DP. Quindi aggiungere idrossilammina cloridrato per convertire l'acetil fosfato rimanente in acetil idrossilato.

Aggiungere la soluzione di sviluppo per convertire l'acetil idrossilato in un complesso di idrossilato ferrico colorato che può essere misurato. La spettrometria basata sulla quantità di substrato di acetil fosfato consumata nei risultati della reazione consente di determinare i parametri cinetici dell'enzima. Il vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti si basa sulla misurazione diretta del consumo di acetil fosfato piuttosto che sul disaccoppiamento di una produzione di TP alla riduzione di un A DP. Poiché questo test non si basa su una produzione di TP, può essere utilizzato per un nuovo gruppo di acetato chinasi, che producono fosfato di potenza invece di un TP Per una curva standard da sei a otto punti, diluire la soluzione madre di acetil fosfato in triss da 100 millimolari fino a un volume finale del campione di 300 microlitri includere anche un campione di controllo senza acetil fosfato equilibrare tutti i campioni in un blocco termico di 37 gradi Celsius per Un minuto.

Ora, aggiungere 50 microlitri di cloridrato idrossilamina molare, mescolare agitando tre volte e incubare in blocco termico a 60 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di sviluppo, mescolare agitando tre volte e lasciare che il colore si sviluppi per almeno un minuto a temperatura ambiente. Centrifugare i campioni utilizzando cuvette di plastica per lo spettrofotometro.

Misurare i campioni a 540 nanometri. Procedere alla generazione di una curva standard di assorbanza a 540 nanometri rispetto a micromoli di acetil fosfato con un software di analisi dei dati e grafici appropriato. Calcola il valore r al quadrato.

Distribuire aliquote da 300 microlitri di miscela di reazione nelle provette della microcentrifuga. Ricordarsi di includere una reazione di controllo senza provette di equilibrio enzimatico per un minuto a 37 gradi Celsius. Se vengono eseguite più reazioni, aggiungere l'enzima alle provette a intervalli di tempo specifici e riportare immediatamente ciascuna provetta al blocco termico di 37 gradi Celsius.

Dopo cinque minuti, aggiungere 50 microlitri di due molari idrossilammina cloridrato, mescolare e incubare cinque minuti a 60 gradi Celsius. Quindi aggiungere 100 microlitri della soluzione di sviluppo, mescolare e posizionarla a temperatura ambiente per lo sviluppo del colore. Quindi centrifugare i campioni a 18.000 volte G per un minuto.

Procedere alla misurazione dell'assorbanza a 540 nanometri. Determinare la quantità di acetil fosfato presente rispetto alla curva standard dell'acetil fosfato. I dati possono essere tracciati e adattati all'equazione di McKayla Cementin per la determinazione dei parametri cinetici.

Questo test determina il consumo del substrato dell'acetil fosfato per misurare l'attività della chinasi dell'acetato nella direzione della formazione dell'acetato. L'acetil fosfato che rimane dopo un dato tempo durante la reazione enzimatica viene convertito in acetil ossibato e successivamente in complesso idrossiato ferrico, che ha un colore rossastro misurabile a 540 nanometri. Questa tipica curva standard che traccia l'assorbanza a 540 nanometri rispetto alle micromoli di acetil fosfato ha una pendenza di 1,2332 unità di assorbanza per micromole di acetil fosfato.

Il valore r al quadrato risultante di 0,99 indica che i dati si adattano bene all'equazione lineare come illustrato qui. Questo test può essere utilizzato per determinare il KM per l'acetil fosfato per varie preparazioni enzimatiche. A cinque millimolari, un DP con concentrazioni variabili di acetil fosfato purificato ricombinante acetato chinasi dal metanolo Sarina termofilo segue la cinetica standard di McKayla simile alla cementina per ciascun substrato, risultando in un KM apparente di 0,27 più o meno 0,01 millimolare di acetil fosfato.

A differenza del saggio accoppiato standard, questo test diretto può misurare l'attività delle acetato chinasi che utilizzano substrati diversi da un TP. Ad esempio, nell'utilizzo dell'acetil fosfato da parte della pirofosfato che produce l'inba histolytica acetato chinasi, il fosfato di sodio è stato sostituito con un DP nella miscela di reazione. La curva risultante indica un valore di KM apparente di 0,50 più o meno 0,006 millimolare di acetil fosfato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea su come misurare direttamente l'attività dell'acetato chinasi determinando la quantità di acetil fosfato consumata.

Un fattore chiave per ottenere risultati riproducibili è essere coerenti in ogni fase, soprattutto nell'aggiunta di enzimi e nella fase di miscelazione.