Tracciamento di segnalazione all'interno di aggregati di cellule ipossiche Encapsulated

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare la risposta cellulare all'ipossia in aggregati cellulari incapsulati in PEG. Nella prima fase, le cellule disperse vengono infettate con il virus marcatore e quindi coltivate su uno shaker per consentire la formazione di aggregati. Successivamente il piolo lineare viene funzionalizzato e il rimer PEG DM viene purificato.

Quindi gli aggregati cellulari vengono incapsulati in un idrogel PEG DM. Infine, gli idrogel vengono coltivati in varie condizioni di ossigeno mentre vengono monitorati in fluorescenza per il segnale del marcatore di ipossia. In definitiva, la posizione e l'entità dell'attività del fattore inducibile dall'ipossia all'interno di aggregati incapsulati vitali di cellule possono essere visualizzate attraverso la semplice microscopia fluorescente.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'incapsulamento cellulare e della somministrazione terapeutica basata su cellule, come ad esempio dove si verifica l'ipossia all'interno delle colture 3D e in che modo influisce sulla sopravvivenza e sulla funzione cellulare? Le implicazioni di questa tecnica si estendono agli approcci di medicina rigenerativa e alla terapia delle carenze ormonali come il diabete a causa del maggiore impatto dell'ipossia nei tessuti aggregati e incapsulati. È stato dimostrato che l'attività del fattore uno inducibile dall'ipossia è correlata a una grande riduzione della secrezione di insulina da parte delle cellule beta, motivando i tentativi di dissociare gli occhielli primari e riformarli in pseudo occhielli.

Aggregati di diametro ridotto. Il nostro marcatore può indicare l'attività del fattore inducibile dall'ipossia con un aggregato a livello cellulare all'interno di qualsiasi materiale di incapsulamento allentato. Il PEG è stato scelto come materiale per capsule per le sue favorevoli proprietà di trasferimento, la compatibilità con il cito e la facilità con cui può essere modificato funzionalmente.

Dopo aver pesato due grammi di PEG in una fiala di vetro da 40 millilitri a circa 308 microlitri di metanfetamina, acrilico, anidride e chiudere liberamente la fiala con un tappo di plastica dura. Microonde la fiala alla massima potenza per due minuti in un normale forno a microonde domestico. Quindi, indossando guanti resistenti al calore, agitare accuratamente la fiala e cuocere la soluzione nel microonde alla massima potenza per altri cinque minuti.

Lasciare brevemente raffreddare la fiala abbastanza da poter essere maneggiata, quindi aprirla mentre si fa roteare la fiala. Mescolare lentamente il cloruro di metilene, agitando il campione secondo necessità fino a quando la soluzione appare limpida e omogenea. Quindi, aggiungere la soluzione goccia a goccia a 200 millilitri di etere datilico freddo agitato per far precipitare il PEG dm.

Quindi raccogliere il PEG DM mediante filtrazione sottovuoto e lasciarlo asciugare. Una volta che il PEG DM si è asciugato, scioglierlo in circa 100-150 millilitri di acqua deionizzata. Quindi dializzare la soluzione contro l'acqua deionizzata per cinque giorni in tubi di dialisi con un cutoff di peso molecolare di 1000 Dalton dopo la dialisi.

Versare la soluzione in contenitori appropriati e congelarli a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Quindi liofilizzare la soluzione per quattro giorni per generare una polvere di PEG DM bianca purificata per rilasciare le cellule dalla superficie del pallone di coltura trattato. Per prima cosa, aspirare il terreno, sciacquare le cellule con 37 gradi CEL di calcio, HBSS senza magnesio e aspirare l'HBSS.

Ora aggiungi due millilitri di viaggi a 37 gradi Celsius e una soluzione di EDTA e lascia che le cellule incubino a 37 gradi Celsius per tre minuti. Quindi scuotere saldamente il lato del pallone per liberare le cellule a otto millilitri di 37 gradi Celsius, a una temperatura media rispetto al pallone e pipettare energicamente la sospensione cellulare su e giù. Facendo attenzione a non introdurre bolle.

Dopo aver trasferito la soluzione cellulare in una provetta da centrifuga sterile da 15 millilitri, contare le cellule con l'emocitometro per determinare il numero totale di cellule da infettare. Aggiungere il volume necessario di sospensione cellulare per ottenere 400.000 cellule per pozzetto nei pozzetti di una piastra di coltura in sospensione a sei pozzetti, aliquotare 50 microlitri di HBSS per pozzetto di cellule da infettare in una provetta per microcentrifuga da 1,8 millilitri. Quindi, pipettare con cura la giusta quantità di sospensione virale nell'HBSS preparato.

Ora aggiungi il volume appropriato di virus diluito a ciascun pozzetto per ottenere il MOI desiderato, quindi aggiungi il terreno a ciascun pozzetto per portare il volume totale fino a 1,7 millilitri. Infine, posizionare la piastra su un agitatore orbitale All'interno dell'incubatore, impostare l'agitatore su un'impostazione bassa di circa 100 giri/min in modo che il terreno lavi delicatamente intorno al pozzetto e lasciare che le cellule si aggreghino per 24-36 ore. Inizia tagliando la punta affusolata di una siringa di plastica da un millilitro e posizionandola aperta in una rastrelliera per creare un recipiente in cui si formerà l'idrogel.

Quindi, pipettare 20 microlitri di soluzione PEG DM fotoattiva nell'estremità aperta della siringa sullo stantuffo, assicurandosi che il volume copra l'intera superficie dello stantuffo. Regolare lo stantuffo con piccoli incrementi per ottenere una superficie piana del fluido. A questo punto, riposizionare la pipetta nel rack e posizionarla sotto una lampada UV per circa otto minuti per consentire la reticolazione dell'idrogel.

Durante questo periodo, il volume della pipetta contenente il numero desiderato di cellule e aggregati è in una provetta per microcentrifuga da 1,8 millilitri. Tappare la provetta e centrifugare le cellule e gli aggregati per cinque minuti a 130 g. Quindi, utilizzando un micropipettatore, rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet cellulare sulla punta del tubo.

Quando la testina del terreno si avvicina al pellet, utilizzare una punta per pipetta più fine da 10 microlitri, disperdendo uniformemente gli aggregati cellulari in tutta la soluzione precursore in gel, assicurandosi che siano completamente incapsulati. È la parte più complicata di questa procedura. Durante l'esecuzione di questo passaggio, fare attenzione a carteggiare nuovamente e trasferire delicatamente il pellet

Ora, risospendere delicatamente il pellet cellulare in 20 microlitri della soluzione fotoattiva PEG DM. Utilizzando una punta di pipetta a bocca larga e aggiungendo la sospensione cellulare alla siringa sopra la porzione di idrogel reticolato, esporre la siringa ad altri otto minuti di luce UV per completare la costruzione dell'idrogel. Al termine, le cellule devono essere completamente incapsulate all'interno dell'idrogel cilindrico.

Infine, aggiungere un millilitro di HBSS in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e un millilitro di terreno in un altro. Bene, quindi espellere l'idrogel dalla siringa nell'HBSS per lavare brevemente il gel. Trasferire il gel nel terreno di coltura e coltivare la piastra nelle condizioni desiderate.

In qualsiasi momento durante la coltura, le cellule possono essere visualizzate utilizzando la microscopia a fluorescenza per tracciare l'inizio del luogo di segnalazione ipossica, la piastra a 24 pozzetti sul tavolino del microscopio, centrando il pozzetto con l'idrogel sotto l'obiettivo. Il segnale è sufficientemente specifico per identificare le singole cellule di segnalazione, ma la risoluzione può essere inadeguata per determinare la localizzazione del segnale intracellulare. Nelle cellule di segnalazione, il segnale è tipicamente osservato uniformemente in tutto il citoplasma.

Questa figura mostra un esempio rappresentativo di aggregati di minx incapsulati in un idrogel PEG all'interno della cellula gel. Gli aggregati devono essere completamente racchiusi nella matrice e distribuiti in modo omogeneo per consentire un migliore trasporto dei nutrienti, come si vede qui. Si noti come il gel reticolante sia solido in tutto, prendendo la forma del recipiente in cui è stata eseguita la reazione.

In questa figura viene mostrata la segnalazione rappresentativa dell'ipossia fluorescente in almeno sei cellule aggregate in un idrogel PEG DM cellule che sono state incapsulate e poi poste in incubazione al 20% di ossigeno per 44 ore. Nella foto a sinistra non mostrano segnalazione di ipossia mentre le cellule che sono state incapsulate e poi incubate in ossigeno al 2% per 44 ore. Come illustrato sul display a destra, l'ipossia del segnale onnipresente può essere tracciata anche in altri tipi di cellule.

Questa figura mostra la segnalazione ipossica rappresentativa in aggregati di cellule staminali mesenchimali incapsulate. Come si vede nella figura più a sinistra, il segnale fluorescente non è rilevabile a 12 ore in 2% di ossigeno, quindi come si vede al centro, la figura è più evidente dopo 24 ore e il 2% di ossigeno. E infine, come si vede a destra è altamente espresso dopo 96 ore e il 2% di ossigeno a seguito di questa procedura.

Altri metodi come Eliza, l'analisi delle proteine secrete e i saggi di vitalità cellulare possono essere eseguiti per correlare la segnalazione ipossica con il fenotipo cellulare. Con questo sviluppo, questa tecnica potrebbe aprire la strada ai ricercatori nei campi dell'ingegneria tissutale e della somministrazione terapeutica basata su cellule per esplorare la funzione di sopravvivenza e la differenziazione delle cellule all'interno di scaffold e materiali di incapsulamento.