Tracciamento di segnalazione all'interno di aggregati di cellule ipossiche Encapsulated

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare la risposta cellulare all'ipossia in aggregati cellulari incapsulati in PEG. Nel primo passaggio, le cellule disperse vengono infettate con il virus marcatore e successivamente coltivate in agitazione per favorire la formazione di aggregati. Successivamente, il peg lineare viene funzionalizzato e il dimer PEG DM viene purificato.

Successivamente, gli aggregati cellulari vengono incapsulati in un idrogel di PEG DM. Infine, gli idrogeli vengono coltivati in diverse condizioni di ossigeno mentre viene monitorato in modo fluorescente il segnale del marcatore di ipossia. In definitiva, la localizzazione e l'estensione dell'attività del fattore inducibile da ipossia all'interno di aggregati cellulari vitali incapsulati può essere visualizzata mediante semplice microscopia fluorescente.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei settori dell'incapsulamento cellulare e della somministrazione terapeutica basata su cellule, come ad esempio: Dove si verifica l'ipossia all'interno delle colture tridimensionali e come influisce sulla sopravvivenza e sulla funzionalità cellulare? Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle strategie di medicina rigenerativa e al trattamento delle carenze ormonali, come il diabete mellito, a causa dell'importante impatto dell'ipossia nei tessuti aggregati e incapsulati. È stato dimostrato che l'attività del fattore inducibile da ipossia uno (HIF-1) si correla con una marcata riduzione della secrezione di insulina da parte delle cellule beta, stimolando tentativi di dissociare gli isolotti primari e riformarli in pseudo-isolotti.

Aggregati di diametro ridotto. Il nostro marcatore può indicare l'attività del fattore inducibile da ipossia mediante aggregati a livello cellulare all'interno di qualsiasi materiale incapsulante rilasciato. Il PEG è stato scelto come materiale per la capsula grazie alle sue favorevoli proprietà di trasferimento, alla compatibilità citologica e alla facilità con cui può essere modificato funzionalmente.

Dopo aver pesato due grammi di PEG in un vial di vetro da 40 millilitri, aggiungere circa 308 microlitri di metacrilico, anidride anidra e chiudere leggermente il vial con un tappo di plastica rigida. Sottoporre il vial a irraggiamento nel forno a microonde regolato alla potenza massima per due minuti in un microonde domestico standard. Successivamente, indossando guanti resistenti al calore, vortexare accuratamente il vial e sottoporre nuovamente la soluzione a irraggiamento nel forno a microonde alla potenza massima per altri cinque minuti.

Lasciare raffreddare brevemente la provetta fino a renderla maneggiabile, quindi svitarne il tappo mentre si ruota la provetta. Aggiungere lentamente il cloruro di metilene, vorticosando il campione secondo necessità fino a quando la soluzione appare limpida ed omogenea. Successivamente, aggiungere la soluzione goccia a goccia a 200 millilitri di etere dietilico freddo sotto agitazione per far precipitare il PEG dm.

Quindi raccogliere il PEG DM mediante filtrazione a vuoto e lasciarlo asciugare. Una volta che il PEG DM è asciutto, scioglierlo in circa 100-150 millilitri di acqua deionizzata. Successivamente, dializzare la soluzione contro acqua deionizzata per cinque giorni in un tubo da dialisi con cutoff di peso molecolare di 1000 Dalton dopo la dialisi.

Versare la soluzione in contenitori appropriati e congelarla a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Successivamente, liofilizzare la soluzione per quattro giorni per ottenere una polvere bianca purificata di PEG DM da utilizzare per il distacco delle cellule dalla superficie della fiasca da coltura trattata. Per prima cosa, aspirare il mezzo, risciacquare le cellule con HBSS privo di calcio e magnesio a 37 gradi Celsius e aspirare l'HBSS.

Ora aggiungere due millilitri di tripsina ed EDTA a 37 gradi Celsius e lasciare incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre minuti. Quindi agitare energicamente il lato del fiasco per staccare le cellule, aggiungere otto millilitri di mezzo a 37 gradi Celsius al fiasco e pipettare vigorosamente la sospensione cellulare su e giù, avendo cura di non introdurre bolle d'aria.

Dopo aver trasferito la soluzione cellulare in una provetta sterile da 15 millilitri per centrifuga, contare le cellule mediante emocitometro per determinare il numero totale di cellule da infettare. Aggiungere il volume necessario di sospensione cellulare per ottenere 400.000 cellule per pozzetto nei pozzetti di una piastra per coltura in sospensione a sei pozzetti; aliquotare 50 microlitri di HBSS per ogni pozzetto di cellule da infettare in una provetta microcentrifuga da 1,8 millilitro. Successivamente, pipettare con attenzione la quantità corretta di sospensione virale nella HBSS preparata.

Ora aggiungere il volume appropriato di virus diluito in ogni pozzetto per ottenere l'MOI desiderato, quindi aggiungere mezzo di coltura in ogni pozzetto fino a raggiungere un volume totale di 1,7 millilitri. Infine, posizionare la piastra su uno shaker orbitale all'interno dell'incubatore, impostando lo shaker su una velocità bassa, circa 100 giri al minuto, in modo che il mezzo fluisca delicatamente all'interno dei pozzetti, e lasciare aggregare le cellule per 24-36 ore. Iniziare tagliando la punta conica di una siringa di plastica da un millilitro e posizionarla con l'estremità aperta verso l'alto su un supporto, creando un contenitore in cui verrà formato l'idrogel.

Successivamente, pipettare 20 microlitri di soluzione di PEG DM fotoattiva nell'estremità aperta della siringa, sopra lo stantuffo, assicurandosi che il volume ricopra l'intera superficie dello stantuffo. Regolare lo stantuffo a piccoli incrementi per ottenere una superficie piatta del liquido. Posizionare ora la pipetta nuovamente nel portapipette e collocare il portapipette al di sotto di una lampada UV per circa otto minuti, consentendo la reticolazione dell'idrogel.

In questo periodo, prelevare con una pipetta il volume contenente il numero desiderato di cellule e aggregati e trasferirlo in una provetta microcentrifuga da 1,8 millilitri. Chiudere il tappo della provetta e centrifugare le cellule e gli aggregati per cinque minuti a 130 ×g. Successivamente, utilizzando una micropipetta, rimuovere con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet cellulare situato alla punta della provetta.

Quando la testa della pipetta si avvicina al pellet, utilizzare una punta di pipetta più fine da 10 microlitri, distribuendo uniformemente gli aggregati cellulari in tutta la soluzione precursora del gel e assicurandosi che siano completamente incapsulati. Questa è la parte più delicata della procedura. Durante l'esecuzione di questo passaggio, prestare attenzione a risospendere e trasferire il pellet con delicatezza.

Ora, risospendere delicatamente il pellet cellulare in 20 microlitri di soluzione fotoattiva di PEG DM. Utilizzando una punta pipetta a bocca larga, aggiungere la sospensione cellulare nella siringa sopra la porzione di idrogel reticolato ed esporre la siringa ad altri otto minuti di luce UV per completare la costruzione dell'idrogel. Al termine, le cellule dovrebbero essere completamente incapsulate all'interno dell'idrogel cilindrico.

Infine, aggiungere un millilitro di HBSS in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e un millilitro di mezzo in un altro. Quindi espellere l'idrogel dalla siringa nell'HBSS per lavare brevemente il gel. Trasferire il gel nel mezzo e coltivare la piastra nelle condizioni desiderate.

In qualsiasi momento durante la coltura, le cellule possono essere osservate mediante microscopia a fluorescenza per seguire l'inizio del segnale ipossico: posizionare la piastra a 24 pozzetti sullo stage del microscopio, centrando il pozzetto con l'idrogel sotto l'obiettivo. Il segnale è sufficientemente specifico da identificare singole cellule attive nella trasduzione del segnale, ma la risoluzione potrebbe non essere adeguata per determinare la localizzazione intracellulare del segnale. Nelle cellule segnalatrici, il segnale viene tipicamente osservato in modo uniforme in tutta la citoplasma.

Questa figura mostra un esempio rappresentativo di aggregati di minx incapsulati in un idrogel di PEG all'interno della cella gel. Gli aggregati devono essere completamente racchiusi nella matrice e distribuiti in modo omogeneo per consentire un migliore trasporto dei nutrienti, come mostrato qui. Si noti come il gel reticolato sia solido in tutta la sua estensione, assumendo la forma del contenitore in cui è stata eseguita la reazione.

In questa figura viene mostrato un esempio rappresentativo del segnale fluorescente di ipossia in aggregati di almeno sei cellule all'interno di un idrogel PEG DM, cellule che sono state incapsulate e successivamente incubate al 20% di ossigeno per 44 ore. Come raffigurato a sinistra, non mostrano segnalazione di ipossia, mentre le cellule incapsulate e poi incubate al 2% di ossigeno per 44 ore, come mostrato a destra, presentano un chiaro segnale ubiquitario. L’ipossia può essere monitorata anche in altri tipi cellulari.

Questa figura mostra un segnale ipossico rappresentativo in aggregati di cellule staminali mesenchimali incapsulati. Come mostrato nella figura a sinistra, il segnale fluorescente non è rilevabile a 12 ore con 2% di ossigeno; successivamente, come visibile nella figura centrale, diventa più evidente dopo 24 ore e 2% di ossigeno. Infine, come osservato nella figura a destra, è fortemente espresso dopo 96 ore e 2% di ossigeno, seguendo questa procedura.

Altri metodi come Eliza, l'analisi delle proteine secrete e i saggi di vitalità cellulare possono essere eseguiti per correlare il segnale ipossico con il fenotipo cellulare. Con questo sviluppo, questa tecnica potrebbe aprire la strada ai ricercatori nei campi dell'ingegneria tissutale e del rilascio terapeutico basato su cellule per esplorare la funzione di sopravvivenza e la differenziazione delle cellule all'interno di impalcature e materiali di incapsulamento.