Modellazione e imaging 3-Dimensional Invasion cella Collettiva

Questo sistema sperimentale mira a caratterizzare il contributo di proteine specifiche al processo invasivo. Iniziare con la trasduzione retrovirale delle cellule mediante la proteina fluorescente di interesse. Creare inoltre la matrice tridimensionale di proteina matrigel negli inserti transwell e preparare una sospensione cellulare alla diluizione appropriata.

Utilizzando il sistema Matrigel transwell, misurare la risposta di transmigrazione verso l'agente chemiotattico con farmaci o trattamenti in esame, quindi procedere alla visualizzazione e all'analisi dell'invasione cellulare mediante microscopia confocale. In definitiva, i risultati possono determinare l'entità e la modalità di invasione cellulare all'interno di una matrice proteica tridimensionale. Il vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il tradizionale saggio di invasione Transwell, risiede nella sua capacità di fornire dati sia quantitativi che qualitativi sull'invasione cellulare in una matrice proteica tridimensionale.

La mia collaboratrice, Diane Creighton, illustrerà ora il metodo: coltivare le cellule impacchettanti retrovirali in DMEM contenente FBS al 10% per 48 ore. Trasfettare le cellule con DNA retrovirale seguendo le istruzioni del produttore. Incubare per 24 ore, lavare i pozzetti due volte con mezzo, quindi aggiungere 1,5 millilitri di DMEM con FBS al 10% per pozzetto ed incubare per 48 ore al fine di raccogliere il retrovirus impacchettato.

Trasferire il mezzo di coltura cellulare in provette microcentrifuga da due millilitri, centrifugare per formare un pellet di eventuali cellule e raccogliere il sopranatante in una provetta pulita. Conservare questa scorta di retrovirus a meno 80 gradi Celsius. Ora, per le cellule retrotrasdotte, rimuovere il mezzo da una coltura notturna e aggiungere un millilitro di scorta di retrovirus integrata con poli verde.

Dopo un'incubazione di sei ore, aggiungere due millilitri di F-B-S-D-M-E-M al 10% nel pozzetto e posizionare le piastre in un incubatore a 37 gradi Celsius. Durante la notte, rinnovare il mezzo e dopo 24 ore, aggiungere il mezzo selettivo appropriato; quando le cellule sono confluenti, raccoglierle e separarle in base alla fluorescenza utilizzando cellule non trasdotte come riferimento. Raccogliere le cellule con fluorescenza superiore rispetto alle cellule non trasdotte e congelare aliquote a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro.

Questo metodo si basa sull'espressione di proteine fluorescenti per la visualizzazione e consente di determinare il contributo delle singole cellule. Lasciare il gel di matrice completo sul ghiaccio e quindi diluirlo uno a uno in PBS freddo di ghiaccio. Inserire ora i transwell non rivestiti in una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti.

Quindi pipettare con attenzione 100 microlitri di matri gel diluito nei pozzetti e far solidificare a 37 gradi Celsius. Nel frattempo, preparare le sospensioni cellulari marcate con fluorocromo nel normale mezzo di crescita. Quando il matri gel si è solidificato, capovolgere i transwell e pipettare 100 microlitri della sospensione cellulare sul lato inferiore del filtro rivolto verso l'uscita.

Coprire con attenzione i transwell utilizzando la base di una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti, facendo aderire ogni goccia di sospensione cellulare. Incubare la piastra in posizione capovolta per quattro ore per consentire l'adesione delle cellule. Ora ruotare le piastre in posizione normale e lavare ogni transwell immergendolo due volte in un millilitro di mezzo privo di siero.

Quindi posizionare il transwell in una terza pozzetta contenente farmaci o reagenti per il trattamento. Con una pipetta, aggiungere delicatamente 100 microlitri di mezzo contenente il chemiotrattante nel transwell, sopra la miscela solidificata di Matrigel e PBS. Incubare per tre-cinque giorni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per acquisire immagini di cellule non fluorescenti che invadono il Matrigel.

Posizionare i transwell in nuove piastre a 24 pozzetti e pipettare. Un millilitro di soluzione di calcio AM a quattro micromolari su ciascun tappo di matri gel, permettendo al liquido di fuoriuscire lateralmente e di colorare sia dalla parte superiore che da quella inferiore. Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con il 5% di anidride carbonica. Successivamente, acquisire le immagini mediante microscopia confocale.

Questo primo metodo di colorazione vitale consente la visualizzazione delle modalità di invasione. Trasferire ogni transwell in una nuova piastra a 24 pozzetti, aggiungere un millilitro di paraformaldeide al 4% e Triton X-100 allo 0,2%, quindi incubare a temperatura ambiente per mezz'ora. Dopo aver lavato tre volte con un millilitro di PBS, aggiungere RNAse A per 30 minuti, quindi lavare due volte con PBS per la visualizzazione a 0,01 milligrammi per millilitro.

Ioduro di propidio diluito in PBS e lasciare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti. Lavare tre volte con PBS. A questo punto, i transwell colorati con ioduro di propidio possono essere conservati a temperatura ambiente al buio per almeno un mese.

Il secondo metodo di colorazione cellulare richiede una fissazione, ma consente una quantificazione più rapida dell'invasione. Utilizzando un microscopio confocale invertito, posizionare il transwell con una piccola quantità residua di PBS su un grande coprioggetto, impiegando un obiettivo da 20x non a immersione, ed acquisire sezioni ottiche ogni 10-15 micrometri a partire dalla base del tappo di matrigel. Quantificare l'entità dell'invasione utilizzando singole sezioni ottiche. Inoltre, ricostruire oggetti tridimensionali mediante un software appropriato, come Velocity, a partire da questa serie di sezioni ottiche; le cellule sono state colorate con calcio am.

Come previsto, il numero di cellule che invadono dal basso verso l'alto attraverso il filtro diminuisce con la distanza. Questa invasione può essere quantificata. Le ricostruzioni tridimensionali dell'invasione cellulare offrono una rappresentazione visiva della modalità di invasione.

Se le cellule sono marcate mediante l'espressione di proteine fluorescenti, allora le posizioni di ciascuna cellula colorata possono essere visualizzate in ricostruzioni tridimensionali come mostrato in questa vista laterale. Inoltre, sezioni attraverso la ricostruzione possono fornire informazioni sui meccanismi molecolari. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare questo saggio di invasione cellulare per ottenere maggiori informazioni sul processo evasivo rispetto a quanto ottenibile con i metodi standard.