Sesso Dimorfismo muscolo scheletrico da Proteomica

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la specificità di genere delle differenze nei profili del proteoma del muscolo scheletrico. Questo viene ottenuto innanzitutto trinciando e omogeneizzando accuratamente i tessuti del muscolo bicipite brachiale di topi maschi e femmine al fine di estrarre la maggior parte delle proteine. Successivamente, il campione viene applicato su una striscia di gel IEF e le proteine vengono separate in base al loro punto isoelettrico, seguito da una corsa SDS-PAGE, che separa in una seconda dimensione in base alla dimensione. Dopo la colorazione e l'acquisizione delle immagini dei gel, i profili proteomici dei campioni muscolari di maschi e femmine vengono confrontati e i spot con differenze significative nell'abbondanza tra i due sessi vengono escissi.

Infine, le proteine nei frammenti di gel vengono digerite con tripsina. I peptidi risultanti vengono estratti dal gel e sottoposti a nano cromatografia liquida e analisi mediante spettrometria di massa per l'identificazione. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'espressione differenziale di proteine in due o più condizioni sperimentali mediante elettroforesi su gel bidimensionale e proteomica basata su spettrometria di massa.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla specificità muscolare di genere, può essere applicato anche ad altre cellule, tessuti, organi o fluidi in diversi stati fisiologici. A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Kalina Diva, direttore tecnico del Smith College Center for proteomics. Dopo aver isolato, pulito e tritato il muscolo scheletrico di topo con 45 microlitri di buffer di estrazione per grammo di tessuto, fare riferimento al protocollo scritto per questo e per tutti gli altri composti dei buffer, omogeneizzare il tessuto sette volte per 15 secondi ciascuna a quattro gradi Celsius, raffreddando due minuti in ghiaccio tra un'omogeneizzazione e l'altra utilizzando un pestello motorizzato.

Centrifugare i campioni a 15.800 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Conservare il soprannatante e misurare il suo volume. Scartare il pellet per precipitare le proteine in tre volumi di ghiaccio.

Acetone di grado reagente freddo per volume di sopranatante. Vortexare i tubi per 15 secondi, quindi centrifugare a 15.800 ×g per 10 secondi per formare i pellet. Eliminare il sopranatante e risospendere i pellet nel buffer di estrazione utilizzando il pestello motorizzato e le bacchette di agitazione in polipropilene; precipitare le proteine una seconda volta aggiungendo ulteriori tre volumi di acetone.

Dopo aver risospeso il pellet nel buffer di estrazione, determinare la concentrazione proteica e/o conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius. Per eseguire la focalizzazione isoelettrica delle proteine, rimuovere una striscia IPG pronta dal congelatore a meno 20 gradi Celsius e lasciarla equilibrare a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Vortexare il campione e pipettare da 600 a 800 microgrammi di proteina in una linea retta lungo il bordo posteriore di un canale nella vaschetta di riettificazione del campione, lasciando circa un centimetro libero a ciascuna estremità.

Utilizzando pinzette, rimuovere il rivestimento di plastica del nastro IPG, avendo cura di toccare soltanto le estremità del nastro ed evitando qualsiasi contatto con il gel. Notare l'estremità contrassegnata come positiva del nastro e posizionarla sul lato sinistro del vassoio. Posizionare il nastro IPG con il lato del gel rivolto verso il basso sopra il campione.

Evitare di intrappolare bolle d'aria al di sotto. Lasciare idratare per un'ora. Ricoprire la striscia con 2,5 millilitri di olio minerale.

Coprire il vassoio con un coperchio e lasciarlo idratare durante la notte. Il giorno successivo, a temperatura ambiente, posizionare una miccia di carta a entrambe le estremità del canale di messa a fuoco e inumidire ciascuna con 10 microlitri di acqua millipore. Rimuovere la striscia IPG e tenerla in posizione verticale per circa 10 secondi.

Per drenare l'olio, tamponare il supporto in plastica con un fazzoletto Kim. Posizionare la striscia IPG con il lato del gel rivolto verso il basso e l'estremità basica a sinistra. Nel vassoio di focalizzazione, ricoprire la striscia con 2,5 millilitri di olio minerale.

Posizionare il vassoio nella cella protean IEF e programmare un protocollo in tre fasi a una temperatura cellulare predefinita di 20 gradi Celsius, con una corrente massima di 50 microampere per striscia e senza tempo di riidratazione. Al termine del programma, trasferire la striscia gel con il lato attivo verso l'alto in un vassoio di equilibrazione da 11 centimetri. Aggiungere quattro millilitri di tampone riducente al canale ed equilibrare la striscia per 10 minuti con agitazione delicata.

Rimuovere il tampone di riduzione e aggiungere quattro millilitri di tampone di alchilazione nel canale, equilibrando la striscia con agitazione per ulteriori 10 minuti. Risciacquare la striscia IPG immergendola brevemente in tampone di corsa XSDS 1X. Successivamente, posizionare la striscia con il lato del gel rivolto verso l'alto sulla piastra posteriore di un criterio da 11 centimetri.

Posizionare delicatamente un gel preformato di tris-H-Cl-SDS poliacrilammide dal 10,5 al 14% in modo che entri in completo contatto con il gel SDS. Accertarsi che non rimangano bolle d'aria intrappolate tra le due superfici del gel. Ricoprire la striscia IPG con un millilitro di soluzione di agarosio fusa e lasciarla solidificare per cinque minuti.

Quindi caricare cinque microlitri di marcatore proteico nel singolo pozzetto. Far correre il gel nel tampone SDS a 200 volt a temperatura ambiente o a quattro gradi Celsius. Quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel, rimuoverlo dalla placca di plastica e colorarlo per tutta la notte agitando delicatamente in blu brillante di Kumasi.

Agitare il gel nella soluzione di fissaggio uno per due volte, per tre ore ciascuna, e nella soluzione di fissaggio due per tutta la notte. Conservare il gel in acido acetico al 7% per l'analisi. Dopo aver acquisito l'immagine del gel, eseguire un'analisi comparativa dei modelli di spot tra i gel e ritagliare gli spot di interesse; aggiungere 200 microlitri di soluzione di fissaggio ai tasselli di gel, vortexare e incubare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti con agitazione.

Quindi rimuovere con attenzione e scartare la soluzione e ripetere l'operazione. Aggiungere 30 microlitri di tampone riducente appena preparato nei tubi contenenti i plug di gel e incubare a 60 gradi Celsius per 10 minuti. Lasciare raffreddare i campioni.

Quindi rimuovere e scartare il tampone. Aggiungere 30 microlitri di tampone di alchilazione e incubare i campioni al buio a temperatura ambiente per un'ora; successivamente, rimuovere e scartare il tampone di alchilazione. Lavare i plug di gel aggiungendo 200 microlitri di soluzione di desolfurazione a ciascuna provetta e incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Rimuovere e scartare la soluzione di ritenzione e ripetere il lavaggio. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di acetonitrile nei tasselli di gel e incubarli per 10 minuti a temperatura ambiente per consentire la riduzione dimensionale e l'essiccazione. Quindi rimuovere con attenzione l'acetonitrile e ripetere l'operazione sui pezzi di gel.

Deve apparire bianco e di piccole dimensioni. Lasciare asciugare i pezzi di gel in un concentratore per 10 minuti. Far gonfiare i pezzi di gel aggiungendo 10 microlitri di soluzione di tripsina attivata.

Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Aggiungere 25 microlitri di buffer di digestione nei tubi. Incubare i campioni a temperatura ambiente tutta la notte con agitazione, sottoporre i campioni a sonicazione per 10 minuti e centrifugarli prima di trasferire il soprannatante in un tubo nuovo.

Per estrarre ulteriormente i peptidi, aggiungere 10 microlitri di acido formico 0,1% ai tappi e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente con agitazione; sottoporre i campioni a sonicazione per 10 minuti. Raccogliere il soprannatante e combinarlo con il soprannatante precedentemente conservato. Le proteine possono quindi essere desalate e preparate per la spettrometria di massa accoppiata a HPLC; muscolo scheletrico di soggetti maschi e femmine non esercitati è stato estratto e separato in una mappa bidimensionale.

Il primo livello del proteoma muscolare, una volta visualizzato mediante imaging digitale ad alta risoluzione, ha mostrato circa 800 punti proteici in ciascun campione, come mostrato qui. Utilizzando la mappa del proteoma maschile come riferimento, è evidente che esistono numerosi punti la cui abbondanza varia nel proteoma femminile: i punti aumentati di almeno due volte nelle femmine sono cerchiati in rosso, mentre quelli diminuiti di almeno due volte sono cerchiati in blu. Le identità dei punti proteici che variano di più di due volte in aumento o diminuzione e che risultano statisticamente significativi con un N di cinque topi sono state determinate mediante analisi della sequenza amminoacidica utilizzando spettrometria di massa accoppiata a cromatografia liquida.

In questo grafico, l'asse x rappresenta topi femmina prima dell'esercizio, e l'asse Y rappresenta un gruppo di punto temporale all'ora zero di un singolo episodio. I risultati mostrano che le femmine presentano una marcata riduzione del metabolismo energetico da zuccheri, degli enzimi e delle isoforme dell'enzima creatina chinasi, un diverso sistema di approvvigionamento energetico nei muscoli. Sia gli esseri umani che gli animali mostrano livelli sierici di CK più elevati nei maschi a riposo e dopo l'esercizio, ma i livelli sierici di CK non correlano necessariamente con la quantità di miofibrille.

Questo dimorfismo di genere nell'abbondanza cellulare della CK nel muscolo bicipite brachiale di miren è un risultato nuovo e potrebbe spiegare i livelli sierici di CK fisiologicamente diversi. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come il blotting immuno quantitativo possono essere eseguiti per verificare i risultati. Dopo aver visto questo video, dovremmo avere una buona comprensione di come preparare e separare i campioni per un'analisi differenziale del proteoma.