Creare fratture rigidamente stabilizzati per la Valutazione ossificazione intramembranosa, osteogenesi per distrazione, o guarigione di difetti critici Sized

L'obiettivo generale di questa procedura è creare una tibia fissata esternamente che possa essere utilizzata per l'analisi della guarigione di fratture stabilizzate, della distrazione, dell'osteogenesi e della riparazione di un difetto a perdita di segmento. Innanzitutto, gli anelli del fissatore vengono posizionati e mantenuti in sede inserendo pin sterili per insetti nella porzione prossimale e distale della tibia, quindi fissando gli anelli ai pin sterili per insetti. Successivamente, viene creato una frattura o un'osteotomia nella diafisi mediale della tibia. Nell'ultimo passaggio della procedura, viene inserita la terza barra filettata per stabilizzare completamente gli anelli prossimale e distale.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano i meccanismi di guarigione delle fratture, di distrazione, di osteogenesi e di innesto osseo attraverso analisi radiografiche, istologiche e molecolari. A dimostrare la procedura saranno i ricercatori senior, la dottoressa Diane, Y Yuu e la ricercatrice post-dottorato dottoressa Chelsea Baney, dell'Università della California di San Francisco, Ospedale Generale di San Francisco. Presso il laboratorio dell'Istituto di Traumatologia Ortopedica per la rigenerazione scheletrica, iniziare assemblando il dispositivo di fissazione esterna appositamente progettato.

I telai di fissazione sono composti da due anelli in alluminio stabilizzati da tre aste filettate in acciaio inossidabile, otto dadi esagonali e 17 bulloni corrispondenti. Per ogni frattura sono necessari due anelli in alluminio: per realizzare l'anello prossimale, avvitare saldamente quattro dadi esagonali e i corrispondenti bulloni nei fori appropriati. Per realizzare l'anello distale, avvitare nuovamente quattro dadi e bulloni senza serrare completamente; quindi inserire due delle aste filettate lunghe che stabilizzeranno il fissatore nei fori posizionati alle ore 12 e alle ore 6, e fissarle con due dadi esagonali.

Anestetizzare un topo dell'età e del sesso desiderati mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina. Verificare l'anestesia completa mediante il test di pizzicamento dell'alluce. Dopo aver rimosso il pelo e aver lavato con un antisettico, applicare un lubrificante oculare, quindi posizionare il topo su un tappetino riscaldante per tutta la durata della procedura.

Posizionare l'anello prossimale sull'arto con i dadi rivolti in direzione distale e spostare l'anello al di sopra dell'articolazione del ginocchio. Fissare la metafisi prossimale e distale della tibia sinistra utilizzando quattro pinze sterili per insetti di 0,25 millimetri, collegando le pinze a un trapano e inserendole attraverso l'osso. Orientare le pinze perpendicolarmente all'asse lungo della tibia e a 90 gradi l'una rispetto all'altra, lasciando almeno 10 millimetri di distanza tra le pinze prossimali e quelle distali.

Fissare i perni all'anello prossimale, mantenendo la tibia posizionata centralmente all'interno dell'anello di alluminio. Posizionare il secondo anello al di sotto dei perni distali. Fissare le due aste all'anello prossimale e quindi bloccare i perni all'anello utilizzando i dadi esagonali.

Come in precedenza, creare la frattura trasversale mediante flessione a tre punti con un dispositivo appropriato. Appoggiare la superficie laterale posteriore della tibia sui blocchi. Sollevare il peso a un'altezza predeterminata lungo il braccio di caduta e lasciarlo cadere in modo che colpisca l'aspetto anterolaterale della tibia.

Per ottenere la frattura trasversa, confermare la frattura mediante radiografia. Successivamente, fissare l'ultima barra filettata in acciaio inossidabile agli anelli partendo dall'estremità distale. Inserire la barra e avvitare un dado sull'anello distale per fissare la barra.

Quindi posizionare un altro dado sulla barra in modo che l'anello prossimale si trovi in alto. Assicurarsi che i due anelli siano mantenuti a distanze uguali e che non esercitino tensione sui perni. Fissare l'anello prossimale alle barre con un terzo dado.

Aggiungere aamaz all per invertire l'anestesia e buprenorfina per analgesia e monitorare gli animali fino a quando non diventano reattivi e deambulanti. Successivamente, somministrare iniezioni sottocutanee di buprenorfina per analgesia e nuovamente, quattro ore dopo, per la distrazione osteogenica standard. Utilizzando questo modello, posizionare i fissatori sul tibia, creare una frattura e lasciarli a riposo per un periodo di latenza di cinque giorni.

Dopo cinque giorni, eseguire l'osteogenesi distrattiva ruotando i dadi sulle barre di stabilizzazione. Un quarto di giro ogni giorno per sette giorni. Gli animali vengono monitorati attentamente nel periodo postoperatorio per valutare la necessità di analgesia aggiuntiva.

Il ponte osseo viene osservato entro 10 giorni, mentre la consolidazione completa si verifica entro 27 giorni dal termine della distrazione. Dopo aver somministrato l'anestesia, rimosso il pelo con un depilatore e pulito la cute con un antisettico, applicare i fissatori come precedentemente descritto. Posizionare il topo sotto il microscopio stereoscopico per visualizzare la tibia mediale, quindi praticare un'incisione lunga da cinque a sette millimetri con una lama numero 10 montata su bisturi.

Recidere delicatamente e separare il muscolo per esporre la diafisi media della tibia. Utilizzando la punta di un paio di forbici, tagliare lentamente un segmento di tre millimetri di tibia, avendo cura di non spostare l'osso con una forza meccanica eccessiva. Rimuovere quindi eventuali frammenti ossei residui con una pinzetta.

Dopo aver esaminato il sito chirurgico alla ricerca di frammenti ossei, riposizionare il muscolo intorno alle estremità smussate della tibia. Chiudere l'incisione cutanea con due o tre punti di sutura in polifilamento 6.0, quindi inserire la terza asta per stabilizzare il fissatore esterno. Come mostrato in precedenza, sospendere l'anestesia, somministrare analgesici e continuare a monitorare gli animali per rilevare segni di dolore.

Come descritto in precedenza, se correttamente applicati, i fissatori esterni forniscono una stabilità altamente rigida della frattura tibiale chiusa con un'eccellente riduzione, come mostrato in questo radiografo scattato dopo la frattura, con i segmenti ossei ben allineati indicati dalla freccia. Le fratture stabilizzate mediante questo metodo guariscono principalmente attraverso l'ossificazione intramembranosa. Mostrato qui mediante colorazione tricromatica, il frammento stabilizzato presenta una certa quantità di nuovo osso nel sito della frattura. Al contrario, se la frattura non viene stabilizzata, si forma un ampio callo cartilagineo nella zona di frattura, il quale viene successivamente sostituito da osso attraverso il processo di ossificazione endocondrale dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ortopedia per esplorare i meccanismi della guarigione delle fratture stabili nei topi.