Su larga scala di registrazione dei neuroni da sonde mobili in silicio Comportarsi Roditori

Ciao, Shane, sono Monty del Bija Lab. Oggi ti mostrerò come utilizzare sonde al silicio per effettuare registrazioni elettrofisiologiche ad alta densità dell'attività unitaria e del potenziale di campo locale in ratti svegli e in attività. Ti mostrerò come realizzare un piccolo microdrive, fissare una sonda al silicio ad esso e quindi impiantare la sonda nel cervello per registrazioni croniche.

Questo processo è piuttosto semplice, ma comprende diverse fasi. Cominciamo dunque. Ecco una piccola collezione di microdrive per ratti e topi, progettati e realizzati negli anni, per il posizionamento di singoli fili, sonde tetrode e sonde in silicio.

Le sonde al silicio possono essere collegate a schede a circuito stampato rigide o a cavi flessibili in poliammide. Qui vi mostreremo come fissare questa sonda a quattro shank a un microdrive. Per preparare un drive, abbiamo bisogno di una piastra in ottone, una punta da trapano di dimensione 55 e 65, un maschio filettatore, un connettore a perno singola fila, una vite 0 0 90 e il relativo dado, un portapunta e un cacciavite.

Il primo passo consiste nel staccare un pezzo da tre pin dall'intestazione. Estrarre delicatamente il pin centrale, allargare un foro praticandolo con una punta da trapano numero 65. Quindi tagliare un filetto utilizzando il ta.

Tagliare due pezzi dalla piastra di ottone. Limare i bordi della piastra con un trapano Dremel e praticare un foro al centro di entrambi i pezzi utilizzando una punta di diametro 55. L'unità viene assemblata temporaneamente in modo che le piastre di ottone tocchino i perni; stringere delicatamente le viti affinché l'assemblaggio risulti stabile.

I perni sporgono quindi vengono saldati alle piastre di ottone. Il microattuatore è quasi pronto: si lima un'estremità sporgente della vite e la si salda al perno. Ora abbiamo un microattuatore estremamente leggero.

La rotazione in senso orario solleverà il ponte di plastica. La sonda al silicio può essere fissata al drive mediante due componenti. Il peso dell'elastomero di protezione in seta entra in gioco.

Mescolare i componenti in un rapporto di dieci a uno. Utilizzando un applicatore di cotone affilato, applicare questo rivestimento all'estremità superiore della sonda. Lasciare asciugare in un forno preriscaldato a 60 gradi Celsius per almeno due ore.

Per assicurare che i siti di registrazione siano privi di qualsiasi residuo, è necessario pulire le punte. Preparare una diluizione di detergente contra in rapporto 1:4. Lasciare in ammollo la sonda nel detergente a 63 gradi Celsius per almeno due ore.

Il detergente deve essere rimosso immergendo ripetutamente la sonda in acqua distillata prima di fissare la sonda al supporto. L'impedenza di ciascun sito di registrazione deve essere verificata utilizzando una lametta da rasoio. Praticare diverse scanalature nel ponte per creare una superficie irregolare, utilizzando due micromanipolatori.

La sonda viene posizionata opposta al ponte del trasduttore. Successivamente, la sonda viene fissata al ponte con cemento adesivo prima dell'intervento chirurgico. Vengono preparati gli elettrodi di riferimento e di massa.

Saldare un'estremità di un filo di rame isolato per circa un millimetro. Utilizzando un ago, grattare la testa di una vite in acciaio inossidabile 0 0 90 e saldare il filo di rame ad essa. Fare attenzione a impedire che il saldante penetri nella scanalatura della vite.

Tagliare pezzi trapezoidali dalla rete di rame. Questi pezzi verranno assemblati per proteggere la testata. Gli strumenti chirurgici e le preparazioni sono gli stessi utilizzati in molte chirurgie su piccoli animali.

Si noti che l'intervento chirurgico mostrato in questo video è esclusivamente a scopo dimostrativo, finalizzato a garantire una visibilità e una ripresa adeguate. Diversi passaggi preparatori, precauzioni chirurgiche e procedure post-operatorie non sono mostrati in questo video. Si raccomanda di consultare le linee guida appropriate per la chirurgia su roditori.

L'intervento chirurgico viene eseguito interamente sotto gas anestetico e in condizioni asettiche. Dopo un'incisione cutanea mediana, vengono rimossi cute e periostio, e il cranio viene pulito e asciugato. Vengono misurati la posizione e la distanza tra bregma e lambda, in modo da determinare le coordinate X e Y della posizione da individuare, che possono essere segnate sul cranio prima di procedere all'apertura.

Per l'innesto della sonda, diverse viti vengono avvitate a metà nell'osso, sia sulla parte superiore che su quella laterale; vengono inoltre preparati dei fori sopra il cranio per inserire gli elettrodi. L'utilizzo di più viti è fondamentale per fissare stabilmente la testa dello stadio al cranio in esperimenti cronici a lungo termine. Utilizzando un piccolo pennello, applicare il metacrilato attivatore sul dentino su tutta la superficie del cranio.

Quindi risciacquarlo con soluzione fisiologica. Successivamente, viene applicato con attenzione uno strato di cemento dentale che ricopre un'equipaggio di catenaria. I quattro lembo di rame sono quindi fissati a questo cranio mediante cemento ad alta adesione.

Ora siamo arrivati alla parte più critica dell'intervento chirurgico: la preparazione del sito di impianto della sonda utilizzando una punta rotonda. La foratura viene eseguita in più fasi e l'osso viene frequentemente irrorato con soluzione fisiologica.

Il lembo osseo viene rimosso con attenzione e la superficie viene irrorata per rimuovere la zura. Sono necessari due strumenti. L'uncino preparato da un ago per insetti e una lama affilata sollevano e tagliano il tessuto con sanguinamento minimo, che può essere risolto mediante irrorazione con soluzione salina.

Se si verifica un'emorragia grave o se la neocorteccia è compromessa in qualsiasi modo, si dovrebbe prendere in considerazione la possibilità di interrompere l'intervento chirurgico e preparare un altro animale. Ora stiamo impiantando la sonda in silicio. La sonda deve essere inserita in un'area priva di vasi, mentre la linea guida dovrebbe essere utilizzata per risolvere emorragie minori.

La sonda viene posizionata approssimativamente a un millimetro sopra la destinazione prevista. L'apertura viene chiusa applicando una miscela calda e fusa di paraffina e olio minerale. La base del supporto è fissata al cranio di Cortes con cemento adesivo.

La parte di collegamento della sonda viene fissata in modo analogo al cranio. L'ultima e fondamentale fase dell'intervento chirurgico consiste nell'assemblare delle linguette in maglia di rame a formare un cilindro protettivo intorno alla sonda e al meccanismo di avanzamento. Il cilindro funge anche da schermo elettrico contro il rumore ambientale e gli artefatti a onde lente prodotti dai baffi carichi.

Nell'animale in attività, l'altezza può essere regolata rimuovendo il materiale in eccesso. I fili del riferimento e della massa sono saldati ai pin appropriati del connettore. La massa è inoltre saldata alla maglia di rame.

Le alette di rame meh sono collegate mediante saldatura e rinforzate con cemento. Alla fine dell'intervento chirurgico, viene nuovamente testato il movimento della vite di comando, e sulla sommità della testa viene posizionata una piattaforma realizzata con un pezzo ricavato da un guanto di gomma dopo un'adeguata cura postoperatoria. Si tratta di un animale sano e collaborativo che, il giorno successivo, appare in ottime condizioni.

Per consentire un libero movimento dell'animale, si raccomanda l'uso di un cavo ultraleggero, ultraflessibile e multitraccia. Il cavo sottile richiede un minimo controbilanciamento e permette un movimento ininterrotto. La qualità della registrazione viene verificata ogni giorno nella gabbia di casa.

La posizione del sito di registrazione viene stimata sia in base ai pattern di scarica delle unità che alla forma dei potenziali di campo locali. Il nostro filmato mostra l'impianto di una singola sonda in silicone, ma registrazioni da più siti mediante l'uso di sonde e sistemi di avanzamento multipli possono essere facilmente eseguite dopo un po' di pratica. Stiamo inoltre utilizzando sistemi simili, ma più piccoli, per impiantare sonde in silicone nel cervello del topo.

Infine, le registrazioni con sonde al silicio possono essere efficacemente combinate con stimolazione luminosa locale del tessuto neurale in esperimenti di optogenetica. Grazie per aver guardato.