Name: Ammide Idrogeno / Deuterio Scambio and massa MALDI-TOF analisi di spettrometria di attivazione Pak2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Scopri lo scambio idrogeno/deuterio e l'analisi MALDI-TOF per studiare l'attivazione della chinasi Pak2. Questo metodo fornisce informazioni sulla dinamica strutturale delle proteine.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è supportato in parte dal National Institutes of Health di Grant GM-26738 (a JAT).

1. Pak2 attivazione <ol><li> Aggiungere l&#39;appropriato pre-testati quantità di caspasi 3-20 l di 12 mg / ml Pak2 nel buffer A (50 mM DTT mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, e 2 a pH 7,5) e incubare a 34 ° C per 30 min a pieno fendere e attivare Pak2. </li><li> Analizzare i prodotti di scissione mediante SDS-PAGE (10%) e Coommassie colorazione blu. </li><li> Aggiungere il Pak2 spaccati di attivazione del buffer B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl 2, 10 mM ATP) a pH 7,5, in 20 microlitri di una concentrazione finale di 10 mg / ml Pak2, e incubare a 34 ° C per 30 minuti per attivare completamente Pak2 da autofosforilazione a 8 siti. </li><li> Conferma scissione completa di Pak2 dalla migrazione dei frammenti p34 e p27 come determinato dalla SDS-PAGE 10. Un&#39;adeguata verifica delle condizioni autofosforilazione avviene tramite autoradiografia in un esperimento separato con (32 P) ATP o spettrometria di massa per rilevare fosfopeptidi. </li></ol> 2. Identificazionedi pepsina-digerito Pak2 Frammenti <ol><li> Aggiungere 1 ml di 0,1% Acido Trifluroacetic (TFA) a pH 2,5 a lavare le perline agarosio due volte prima dell&#39;uso. Poi, centrifugare i campioni per 15 sec a 2.000 xg per rimuovere le perline. </li><li> Aggiungi Pak2 (20 mg in 2 ml di 150 mM NaCl, 50 mM DTT mM Tris-HCl e 2 a pH 7,5) a 100 ml di 0,1% TFA, e incubare il campione per 5 minuti con 30 ml di pepsina-coniugato perline agarosio . </li><li> Equilibrare una inversione di fase colonna HPLC C18 con un sistema primario di solvente 0,1% TFA a pH 2.5. Il digest pepsina (50 ml) viene eluito con un lineare da 100 min gradiente di 0-80% acetonitrile contenente 0,1% TFA ad un flusso di 0,2 ml / min. Le frazioni vengono raccolti ogni 2 min. </li><li> Asciugare le frazioni HPLC con uno speed-vac (3 h) e risospendere i campioni in una soluzione di acetonitrile (5 mL) e lo 0,1% TFA (5 mL) a pH 2.5. </li><li> Inizialmente, ogni frazione è a screening per peptidi con il MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager DE STR (PE Biosystems, Foster City, CA, USA). </li><li> Le 16 frazioni contenenti peptidi sono sottoposti a spettrometria di massa tandem con un Q-TOF spettrometro di massa e un QSTAR XL oMALDI MS / MS per identificare i frammenti. </li><li> La sequenza di ciascun peptide è verificata dagli ioni prodotto generato dalla spettrometria di massa tandem con il teorico m / z coefficienti basati sulla sequenza principale del Pak2 Usando il sito web Protein Prospector ( <a href="http://prospector.ucsf.edu/">http://prospector.ucsf.edu/</a> ) 11. </li></ol> 3. Misura della Amide H / D Cambio <ol><li> Tenere tutte le soluzioni e reagenti necessari per H / D cambio a 25 ° C a bagnomaria. ATP viene disciolto in acqua e il pH è regolato a 7,0 prima dell&#39;uso. L&#39;ulteriore 4mm ATP in D 2 O buffer è di impedire ATP dissociato dal Pak2 dopo la diluizione. </li><li> Avviare H / D scambio con l&#39;aggiunta di 18 ml di tampone D 2 O (50 mM MOPS pH 6,98, 125 mM NaCl) a 2 microlitri (20 mcg) Di Pak2 in un tampone contenente 150 mM NaCl, 50 mM mM Tris-HCl (pH 7,5) e 2 DTT, che comporti un livello Pak2 di 10 mg / ml e un pH di 7,0 a 0 ° C. </li><li> Incubare i campioni in triplice copia in H / D cambio di 0, 0,5, 1, 3, 5 e 10 minuti, o 24 ore </li><li> Estinguere la H / D processo di scambio con l&#39;aggiunta di 180 ml di ghiacciata TFA 0,1% a pH 2.2, che porta il pH a 2,5 in un volume finale di 200 l. Per i campioni contenenti ATP, 180 ml di ghiacciata TFA 0,11% a pH 2.2 è utilizzato per mantenere il pH a 2,5 in stato bonificato. </li><li> Aggiungere un&#39;aliquota (100 l) di ciascun campione spento a 30 ml di pepsina attivata coniugato perline agarosio. La digestione pepsina è autorizzato a procedere su ghiaccio per cinque minuti ed i campioni sono in agitazione ogni 30 sec. </li><li> Terminare la digestione per centrifugazione del campione per 15 sec a 5.000 xga 4 ° C per rimuovere la pepsina. </li><li> Congelare rapidamente i campioni in liquido N 2 e conservare a -80 ° C per non più di 2giorni prima della MALDI-TOF analisi. </li><li> La matrice di MALDI è di 5 mg / ml di α-ciano-4-idrossicinnamici acido (CHCA) disciolto in una soluzione (1:1:1) di acetonitrile, etanolo e 0,1% TFA a pH 2,5 e tenuto a 0 ° C. </li><li> Parzialmente scongelare rapidamente ogni campione e mescolare 1 ml di ogni campione con 1 l di matrice e spot su un 4 ° C Piastra MALDI. </li><li> Applicare un vuoto moderato al piatto ad asciugare i punti in 30 secondi prima di MALDI-TOF analisi. Il tempo tra scongelamento del campione e il recupero dello spettro è di circa 3 min. </li><li> Acquisire MALDI-TOF spettri di massa con un PerSeptive STR Biosystems Voyager DE. Acquisire dati in un 2-GHz, frequenza di campionamento a 100.000 canali di dati, con un 20.000 V tensione di accelerazione, e una tensione di rete del 65% utilizzando l&#39;estrazione con un ritardo di 180 ns ritardo impulsi. Un centinaio di scansioni sono in media di 2 min. Il MALDI-TOF strumento non si limita a qualsiasi marca o software particolari. </li><li> Utilizzare il programma per computer Data Explorer 4.0 per calculmangiato la deuterazione di ogni frammento. </li><li> Calcolare il cambio posteriore in base al rapporto del numero effettivo deuterone incorporata a 24 ore di H / D cambio divisa per tutti i siti possibili intercambiabili, che sono la spina dorsale amidi, tranne N-terminale ammide (Figura 1). </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: La scissione della caspasi e autofosforilazione sono verificati mediante SDS-PAGE colorazione Commassie. Pak2 inattive è una singola banda di 58 kDa. Scissione della caspasi Pak2 è completa, e produce due frammenti, p27 e p34 che migrano separatamente. La migrazione di autophosphorylated p27 e p34 mostra una sovrapposizione sul gel a causa della ritardata migrazione del frammento completamente fosforilati p27 (Figura 2). H / D esperimenti di cambio vengono effettuate più volte tra 0 e 10 min (Figura 3). A titolo di esempio, la durata d&#39;incorporazione deuterio in m / ZPEAK 1697,85 di Pak2 inattivi è composto da più picchi isotopici, come indicato dallo spostamento della busta di massa nel corso del tempo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig1.jpg" /> Figura 1. Equazione per il calcolo del deuterazione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig2.jpg" /> Figura 2. Autofosforilazione e scissione delle caspasi Pak2. Caspasi-spaccati Pak2 (corsia di sinistra), intatto Pak2 inattiva (corsia centrale) e della caspasi-spaccati autophosphorylated Pak2 (corsia di destra) sono stati analizzati mediante SDS-PAGE e Coommassie colorazione blu. Adattato da Hsu, YH et al 2. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig3.jpg" /> Figura 3. Spettro di massa di un corso momento della costituzione di deuterio per Pak2 inattivi. Pak2 inattivo è stato sottoposto a H / D SCAMBIOESN per 0-10 min e analizzati da MALDI-TOF. Un esempio della distribuzione isotopica del ampliato MALDI-TOF di picco m / z 1697,85 durante il periodo di tempo di H / D scambio è mostrato. La linea rossa tratteggiata indica la media della busta di massa e lo spostamento della busta di massa mostra il deuterazione di un peptide.

<ol><li>Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amide+H%2F2H+exchange+reveals+communication+between+the+cAMP+and+catalytic+subunit-binding+sites+in+the+R%28I%29alpha+subunit+of+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22A.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase.</a> A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).</li>
<li>Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+conformational+changes+during+activation+of+protein+kinase+Pak2+by+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange.</a> J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).</li>
<li>Englander, S. W., Kallenbach, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+and+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids.</a> Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).</li>
<li>Dennis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+the+membrane+binding+region+of+Group+VIA+Ca2%2B-independent+phospholipase+A2+using+peptide+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).</li>
<li>Hsu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+rigidifies+the+C2+domain+and+the+intradomain+interaction+of+GIVA+phospholipase+A2+as+revealed+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).</li>
<li>Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hPAK65+by+caspase+cleavage+induces+some+of+the+morphological+and+biochemical+changes+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).</li>
<li>Rudel, T., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+and+morphological+changes+in+apoptotic+cells+regulated+by+caspase-mediated+activation+of+PAK2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2.</a> Science. 276, 1571-1574 (1997).</li>
<li>Roig, J., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+p21+G+protein-activated+protein+kinase+gamma-PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Vitam.+Horm%22%5BJournal%5D)">Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK.</a> Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).</li>
<li>Walter, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+and+activation+of+p21-activated+protein+kinase+gamma-PAK+by+CPP32+%28caspase+3%29.+Effects+of+autophosphorylation+on+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity.</a> J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).</li>
<li>Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+accurate+mass+measurement+%28%2B%2F-+10+ppm%29+in+protein+identification+strategies+employing+MS+or+MS%2FMS+and+database+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching.</a> Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Identificazione della pepsina-digerito Frammenti è un passo fondamentale della H / D esperimento di scambio. Identificazione errata del peptide può condurre a conclusioni errate. Pak2 pepsina-digerito viene eluito in una colonna HPLC in fase inversa C18 per ottenere un fondo pulito. Nei nostri esperimenti, un totale di 40 frazioni sono state raccolte e sottoposte a MALDI-TOF. Peptidi multipli potrebbero essere identificati in ciascuna delle frazioni. I peptidi sono stati sottoposti a spettrometria di massa tandem (Q-TOF MS / MS e oMALDI MS / MS) per identificare le loro sequenze. La MS / MS spettri di un peptide dovrebbe avere almeno tre ioni prodotto per confermare l&#39;identificazione del peptide. Il programma per computer Data Explorer 4.0 (Applied Biosystems) esegue la correzione iniziale di base e filtraggio del rumore. Ogni spettro deve essere calibrata sulla base di due picchi in sequenza. Noi calibrare il nostro spettro da parte della massa teorica del undeuterated m / z che sono 923,45 e 1697,84. Tlui accuratezza di massa dopo la calibrazione può raggiungere i 10 ppm. Su deuterazione, il mono-isotopo può passare ad una massa maggiore. Aumenta passo unitario a questi m / z rapporti ceduto le masse associate a una maggiore deuterazione. L&#39;intensità dei picchi della busta di massa non influisce sul livello deuterazione. Tuttavia, l&#39;intensità dei picchi dei picchi isotopici in una busta di massa particolare sono fondamentali per il calcolo della massa media. Il primo passo del calcolo del deutone è incorporato sottraendo la massa del peptide non deuterati campione dal campione deuterato. Tre altri fattori, la diluizione D 2 O, il deuteroni residuo nelle catene laterali e il cambio posteriore, dovranno essere ulteriormente considerati nel calcolo (Figura 1). La diluizione D 2 O è il fattore di diluizione D 2 O dopo la miscelazione del campione e D 2 O di buffer di avviare la H / D cambio. Deutone residua (4,5%) nelle catene laterali della pepsina-digerirepeptidi ed ha bisogno di essere sottratto. Il back-scambio è l&#39;inevitabile perdita di deuterazione in tutti i peptidi deuterato e pepsina-digerito nel processo di misura di massa. Il peptide più accessibile solvente (m / z = 1105,60) dopo 24 ore di H / D cambio rappresenta una regione ricca deuterazione. Il numero deuterone incorporato per ciascuno dei peptidi è la differenza tra il baricentro dei peptidi deuterati e non deuterati peptica Pak2. Il più grande deuterati peptide m / z 1105 è stato selezionato per rappresentare deuterazione piena quando Pak2 era a 24 ore di H / D cambio. Il Rapporto di Cambio posteriore è stato calcolato il numero effettivo deuterone incorporata a 24 ore di H / D cambio divisa per tutti i siti possibili scambiabile a peptide m / z 1105.

<table border="1"></table><table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Aldrich </td><td> 7789-20-0 </td><td></td></tr><tr><td> α-ciano-4-acido idrossicinnamici </td><td> Sigma </td><td> 28166-41-8 </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> PE Biosystems </td><td> Voyager DE STR </td><td></td></tr><tr><td> Q-TOF Spettrometro di massa </td><td> Q-TOF Ultima-Global </td><td></td><td></td></tr><tr><td> QSTAR XL oMALDI MS / MS </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dati Explorer 4.0 programma per computer </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr&gt; </tbody></table>

ammide idrogeno / deuterio scambio &amp; massa maldi-tof analisi di spettrometria di attivazione pak2

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Ammide idrogeno / deuterio scambio (H / D cambio) accoppiata a spettrometria di massa è stata ampiamente utilizzata per analizzare l&#39;interfaccia di interazioni proteina-proteina, i cambiamenti conformazionali delle proteine, la dinamica delle proteine ​​e le interazioni proteina-ligando. H / D cambio sulle posizioni ammidico la spina dorsale è stata utilizzata per misurare i tassi deuterazione delle micro-regioni di una proteina mediante spettrometria di massa 1,2,3. La risoluzione di questo metodo dipende dalla digestione pepsina deuterati della proteina di interesse in peptidi che normalmente gamma 3-20 residui. Anche se la risoluzione di H / D cambio misurato mediante spettrometria di massa è inferiore alla risoluzione singolo residuo misurata dal eteronucleari singola coerenza quantistica (HSQC) metodo di NMR, la misurazione della spettrometria di massa in H / D cambio non è limitata dalla dimensione del proteine ​​4. H / D lo scambio avviene in soluzione acquosa che mantiene la conformazione delle proteine. Mettiamo a disposizione un metodo che utilIZES il MALDI-TOF per la rilevazione di 2, al posto di un HPLC / ESI (ionizzazione electrospray)-MS sistema di 5,6. Il MALDI-TOF fornisce dati accurati intensità di massa per i peptidi della proteina digerita, in questo caso Pak2 proteina chinasi (detta anche γ-Pak). Proteolisi di Pak 2 è effettuato in una digestione pepsina non in linea. Questo metodo alternativo, quando l&#39;utente non ha accesso a una colonna HPLC e pepsina collegato alla spettrometria di massa, o quando la colonna pepsina in HPLC non si traduca in una mappa digestione ottimale, per esempio, il pesante disolfuro-bonded secreto fosfolipasi A 2 (SPLA 2). Utilizzando questo metodo, abbiamo monitorato con successo i cambiamenti nel livello deuterazione durante l&#39;attivazione della caspasi 3 Pak2 di scissione e autofosforilazione 7,8,9.

MALDI-TOF spettrometria di massa è stato utilizzato con successo per monitorare la amide idrogeno / deuterio in cambio di attivazione della proteina chinasi Pak2.

Ammide Idrogeno / Deuterio Scambio &amp; massa MALDI-TOF analisi di spettrometria di attivazione Pak2

Lo scambio idrogeno/deuterio delle ammidi (scambio H/D) accoppiato alla spettrometria di massa è stato ampiamente utilizzato per analizzare l'interfaccia di proteine-proteine...

Questo esperimento illustra come utilizzare la spettrometria di massa per monitorare lo scambio idrogeno-deuterio associato alle proteine. I cambiamenti strutturali che portano agli stati attivati innanzitutto clivano la proteina chinasi PAC2 mediante caspasi-3 e successivamente attivano PAC2 attraverso autofosforilazione utilizzando TP come substrato; nel secondo passaggio, digerire PAC2 con pepsina e analizzare i frammenti proteici di PAC2 mediante spettrometria di massa in tandem. Procedere quindi all'analisi dei profili di scambio idrogeno-deuterio di PAC2 mediante monitoraggio "mold off" del livello di deuterazione di ciascun frammento di PAC2. Il livello preciso di scambio idrogeno-deuterio, ottenuto mediante analisi "mold to", fornisce informazioni importanti sul clivaggio operato dalla caspasi-3 e sull'autofosforilazione di PAC2.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande riguardanti la dinamica delle proteine, come i cambiamenti conformazionali delle proteine, le interazioni tra proteine e ligandi, e le interazioni proteina-proteina. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la spettrometria di massa LCQ con scambio di idrogeno deuterato (HD), è strumentale. Questa procedura non richiede una spettrometria di massa accoppiata a HPLC per analizzare i risultati dello scambio HD, ed è semplice da eseguire. Per scindere 0,6 microgrammi di PAC due.Aggiungere la caspasi tre e incubare la reazione a 34 gradi Celsius per 30 minuti. Verificare PAC due e il completamento della scissione di PAC due mediante analisi dei prodotti tramite elettroforesi SDS-PAGE. Per la reazione di attivazione, aggiungere PAC due scisso a 20 microlitri di buffer di attivazione B e incubare a 34 gradi Celsius per 30 minuti.Utilizzare la SDS-PAGE per confermare l'auto-fosforilazione mediante la migrazione dei frammenti P34 e P27. Per prima cosa, lavare due volte le perline di agarosio coniugate con purina con un millilitro di acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,1%, diluire due microlitri di 10 milligrammi per millilitro. Preparare due provette con 100 microlitri di TFA allo 0,1%, aggiungere 30 microlitri delle perline di agarosio coniugate con Pepsi lavate e incubare per cinque minuti.Procedere all'equilibrazione di una colonna HPLC in fase inversa C18 con TFA 0,1% a pH 2,5. Caricare ora il digest di Pepina e diluire utilizzando un gradiente lineare di 100 minuti. Raccogliere le frazioni ogni due minuti dopo aver essiccato le frazioni HPLC con un evaporatore sotto vuoto.Sospendere i campioni in cinque microlitri di acetonitrile e TFA 0,1% a pH 2,5. Come schermo iniziale, analizzare ogni frazione per peptidi mediante MALDI per tutte le frazioni contenenti peptidi.Identificare i frammenti mediante spettrometria di massa in tandem. Utilizzare la funzione MS product in protein prospector per confrontare gli ioni figli e i rapporti MZ teorici basati sulla sequenza primaria di PAC due. Equilibrare prima tutte le soluzioni e i reagenti per lo scambio idrogeno-deuterio.Iniziare lo scambio idrogeno-deuterio aggiungendo 18 microlitri di tampone D₂O a 2 microlitri di 10 milligrammi per millilitro. Preparare due campioni, eseguendo le reazioni in triplicato in un corso temporale. Arrestare la reazione di scambio idrogeno-deuterio con 180 microlitri di TFA 0,1% ghiacciato a pH 2,2.Ora distribuire aliquote di 100 microlitri di idrogeno deuterato. Aggiungere da due a ciascuna di 30 microlitri di perle aggregate coniugate con pepina attivata. Incubare questa digestione con pepina sul ghiaccio per cinque minuti.Vortexare ogni 30 secondi per interrompere efficacemente le reazioni di digestione mediante centrifugazione, al fine di rimuovere rapidamente la Pepin. Congelare i campioni in azoto liquido per evitare la muffa prima dell'analisi. Preparare la matrice e conservarla a zero gradi Celsius, scongelando parzialmente ogni campione rapidamente.Mescolare un microlitro di campione con un microlitro di matrice, quindi applicare su una piastra target muffetta a quattro gradi Celsius 30 secondi prima dell'analisi. Applicare un vuoto moderato sulla piastra per far asciugare. I punti continuano ad acquisire spettri di massa, con una media di 100 scansioni in due minuti.Procedere utilizzando il programma informatico Data Explorer 4.0 per calcolare la durata di ciascun frammento. Quindi calcolare lo scambio inverso in base al rapporto tra l'incorporazione effettiva dovuta a un valore a 24 ore di scambio idrogeno-deuterio diviso per tutti i siti scambiabili possibili, ovvero le ammidi della catena principale, ad eccezione dell'ammidico terminale finale. In questo esempio, il clivaggio e l'auto-fosforilazione di CASP Bay sono verificati mediante colorazione con Kumasi su gel SDS-PAGE.La PAC due non fosforilata inattiva è una singola banda di 58 kilodalton CASP bay's. La scissione della PAC due è completa e produce due frammenti, P 27, il dominio regolatorio, e P 34, il dominio catalitico, a seguito della autofosforilazione. La migrazione di P 27 e P 34 autofosforilati mostra un sovrapposizione sul gel proteico a causa della migrazione ritardata del frammento P 27 completamente fosforilato rispetto alla PAC due non fosforilata.Questo spettro di massa mostra un andamento temporale dell'incorporazione di deuterio per il PAC inattivo due. Il picco MZ 1697.85 è composto da multipli picchi isotopici, come mostrato dallo spostamento dell'inviluppo di massa. Nel tempo, la linea rossa tratteggiata indica la media dell'inviluppo di massa e lo spostamento dell'inviluppo di massa mostra la durata di un peptide una volta acquisito.Questa tecnica può essere completata in due giorni se eseguita correttamente. Non dimenticare che lavorare con azoto liquido può essere estremamente pericoloso, quindi prendere precauzioni come forare il tappo del tubo EOL da 1,5 ml prima di metterlo nell'azoto liquido.

amide-hydrogendeuterium-exchange-maldi-tof-mass-spectrometry-analysis

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Chinasi Ripetere leucina Rich 2 è una chinasi multidominio grande, le cui mutazioni sono la causa genetica più comune della malattia di Parkinson. Analisi delle attività di questa proteina chinasi ha dimostrato di essere uno strumento fondamentale per comprendere la biologia e la disfunzione di questa proteina. In questo...

Saggiare l&#39;attività chinasi di LRRK2 In vitro</em

Proteine ​​conformazione e la dinamica sono la chiave per comprendere il rapporto tra struttura e funzione delle proteine. Scambio idrogeno accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione è un metodo versatile per studiare le dinamiche conformazionali di proteine ​​e caratterizzazione della proteina-ligando e proteina-proteina interazioni, comprese le interfacce di contatto ed effetti allosterici.

Analizzando la dinamica delle proteine ​​che utilizzano l&#39;idrogeno Scambio Spettrometria di Massa

Descriviamo qui un protocollo per la purificazione e caratterizzazione di complessi proteici vegetali. Dimostriamo che immunoprecipitando una singola proteina all'interno di un complesso, in modo da poter identificare le sue modificazioni post-traslazionali e dei suoi partner interagenti.

Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine ​​vegetali Complessi

Utilizzando microarray proteici contenenti quasi tutta la S. cerevisiae proteoma è sondato per un rapido interrogatori imparziale di migliaia di interazioni proteina-proteina in parallelo. Questo metodo può essere utilizzato per la proteina-piccola molecola, modificazione post-traslazionale, e altri saggi in high-throughput.

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

flessibilità conformazionale gioca un ruolo critico nella funzione delle proteine. Qui, si descrive l'utilizzo di spettrometria di massa elettrospray ionizzazione tempo risolto accoppiato a scambio idrogeno-deuterio per sondare i rapidi cambiamenti strutturali che guidano funzione di proteine ​​ordinate e disordinate.

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Le chinasi di proteine ​​sono enzimi e stadi di segnalazione altamente evoluti che sono critici per la trasduzione del segnale inter-e intracellulare. Presentiamo un protocollo per la misurazione dell'attività di chinasi mediante l'uso di trifosfato adenosina radiomarcato ([γ-32P] ATP), un metodo affidabile per aiutare a spiegare la regolazione cellulare di segnalazione.

Analizzare l&#39;attività della proteina con l&#39;ATP radioattivato

Questo flusso di lavoro descrive contemporaneamente le prestazioni dell'arricchimento in termini di tempo ed efficiente in termini di costi di più modifiche post-traslazionali proteiche (PPM) per l'analisi proteomica globale quantitativa. Il protocollo utilizza l'arricchimento PTM a livello di peptide con più anticorpi coniugati, seguito dall'analisi della spettrometria di massa di acquisizione indipendente dai dati per ottenere informazioni biologiche sul crosstalk PTM.

Arricchimento simultaneo dell'affinità di due modifiche post-traduzionali per la quantificazione e la localizzazione del sito

Le sintetasi lanthipeptide catalizzano reazioni multistep durante la biosintesi dei prodotti naturali peptidici. Qui descriviamo un flusso di lavoro continuo, dal basso verso l'alto, di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) che può essere utilizzato per studiare la dinamica conformazionale delle sintetasi lantaipeptide, così come altri enzimi simili coinvolti nella biosintesi del prodotto naturale peptidico.

Una piattaforma di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) per lo studio degli enzimi biosintetici peptidici

L'etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT) è una strategia avanzata di multiplexing del campione in grado di aumentare il numero di campioni che possono essere analizzati contemporaneamente ai tag isobarici disponibili. L'incorporazione di una piattaforma robotica ha notevolmente aumentato la produttività sperimentale, la riproducibilità e l'accuratezza quantitativa.

Multiplexing di campioni automatizzato utilizzando l'etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT)

La capacità di valutare l'impegno target da parte degli inibitori candidati nelle cellule intatte è fondamentale per la scoperta di farmaci. Questo protocollo descrive un saggio di spostamento termico cellulare in formato 384 che rileva in modo affidabile l'impegno del bersaglio cellulare degli inibitori che prendono di mira SHP2 di tipo selvaggio o le sue varianti oncogeniche.

Valutazione dell'impegno del bersaglio cellulare da parte degli inibitori della fosfatasi SHP2 (PTPN11)

Qui presentiamo un protocollo per l'arricchimento delle fosfatasi fosfoproteine endogene e delle loro proteine interagenti da cellule e tessuti e la loro identificazione e quantificazione mediante proteomica basata sulla spettrometria di massa.

Un approccio basato sulla spettrometria di massa per identificare le fosfatasi delle fosfoproteine e i loro interattori

Scopri lo scambio idrogeno/deuterio e l'analisi MALDI-TOF per studiare l'attivazione della chinasi Pak2. Questo metodo fornisce informazioni sulla dinamica strutturale delle proteine.

Ammide Idrogeno / Deuterio Scambio & massa MALDI-TOF analisi di spettrometria di attivazione Pak2

Esplora altri video