Ammide Idrogeno / Deuterio Scambio & massa MALDI-TOF analisi di spettrometria di attivazione Pak2

Questo esperimento illustra come utilizzare la spettrometria di massa per monitorare lo scambio idrogeno-deuterio associato alle proteine. I cambiamenti strutturali che portano agli stati attivati innanzitutto clivano la proteina chinasi PAC2 mediante caspasi-3 e successivamente attivano PAC2 attraverso autofosforilazione utilizzando TP come substrato; nel secondo passaggio, digerire PAC2 con pepsina e analizzare i frammenti proteici di PAC2 mediante spettrometria di massa in tandem. Procedere quindi all'analisi dei profili di scambio idrogeno-deuterio di PAC2 mediante monitoraggio "mold off" del livello di deuterazione di ciascun frammento di PAC2. Il livello preciso di scambio idrogeno-deuterio, ottenuto mediante analisi "mold to", fornisce informazioni importanti sul clivaggio operato dalla caspasi-3 e sull'autofosforilazione di PAC2.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande riguardanti la dinamica delle proteine, come i cambiamenti conformazionali delle proteine, le interazioni tra proteine e ligandi, e le interazioni proteina-proteina. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la spettrometria di massa LCQ con scambio di idrogeno deuterato (HD), è strumentale. Questa procedura non richiede una spettrometria di massa accoppiata a HPLC per analizzare i risultati dello scambio HD, ed è semplice da eseguire. Per scindere 0,6 microgrammi di PAC due.

Aggiungere la caspasi tre e incubare la reazione a 34 gradi Celsius per 30 minuti. Verificare PAC due e il completamento della scissione di PAC due mediante analisi dei prodotti tramite elettroforesi SDS-PAGE. Per la reazione di attivazione, aggiungere PAC due scisso a 20 microlitri di buffer di attivazione B e incubare a 34 gradi Celsius per 30 minuti.

Utilizzare la SDS-PAGE per confermare l'auto-fosforilazione mediante la migrazione dei frammenti P34 e P27. Per prima cosa, lavare due volte le perline di agarosio coniugate con purina con un millilitro di acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,1%, diluire due microlitri di 10 milligrammi per millilitro. Preparare due provette con 100 microlitri di TFA allo 0,1%, aggiungere 30 microlitri delle perline di agarosio coniugate con Pepsi lavate e incubare per cinque minuti.

Procedere all'equilibrazione di una colonna HPLC in fase inversa C18 con TFA 0,1% a pH 2,5. Caricare ora il digest di Pepina e diluire utilizzando un gradiente lineare di 100 minuti. Raccogliere le frazioni ogni due minuti dopo aver essiccato le frazioni HPLC con un evaporatore sotto vuoto.

Sospendere i campioni in cinque microlitri di acetonitrile e TFA 0,1% a pH 2,5. Come schermo iniziale, analizzare ogni frazione per peptidi mediante MALDI per tutte le frazioni contenenti peptidi.

Identificare i frammenti mediante spettrometria di massa in tandem. Utilizzare la funzione MS product in protein prospector per confrontare gli ioni figli e i rapporti MZ teorici basati sulla sequenza primaria di PAC due. Equilibrare prima tutte le soluzioni e i reagenti per lo scambio idrogeno-deuterio.

Iniziare lo scambio idrogeno-deuterio aggiungendo 18 microlitri di tampone D₂O a 2 microlitri di 10 milligrammi per millilitro. Preparare due campioni, eseguendo le reazioni in triplicato in un corso temporale. Arrestare la reazione di scambio idrogeno-deuterio con 180 microlitri di TFA 0,1% ghiacciato a pH 2,2.

Ora distribuire aliquote di 100 microlitri di idrogeno deuterato. Aggiungere da due a ciascuna di 30 microlitri di perle aggregate coniugate con pepina attivata. Incubare questa digestione con pepina sul ghiaccio per cinque minuti.

Vortexare ogni 30 secondi per interrompere efficacemente le reazioni di digestione mediante centrifugazione, al fine di rimuovere rapidamente la Pepin. Congelare i campioni in azoto liquido per evitare la muffa prima dell'analisi. Preparare la matrice e conservarla a zero gradi Celsius, scongelando parzialmente ogni campione rapidamente.

Mescolare un microlitro di campione con un microlitro di matrice, quindi applicare su una piastra target muffetta a quattro gradi Celsius 30 secondi prima dell'analisi. Applicare un vuoto moderato sulla piastra per far asciugare. I punti continuano ad acquisire spettri di massa, con una media di 100 scansioni in due minuti.

Procedere utilizzando il programma informatico Data Explorer 4.0 per calcolare la durata di ciascun frammento. Quindi calcolare lo scambio inverso in base al rapporto tra l'incorporazione effettiva dovuta a un valore a 24 ore di scambio idrogeno-deuterio diviso per tutti i siti scambiabili possibili, ovvero le ammidi della catena principale, ad eccezione dell'ammidico terminale finale. In questo esempio, il clivaggio e l'auto-fosforilazione di CASP Bay sono verificati mediante colorazione con Kumasi su gel SDS-PAGE.

La PAC due non fosforilata inattiva è una singola banda di 58 kilodalton CASP bay's. La scissione della PAC due è completa e produce due frammenti, P 27, il dominio regolatorio, e P 34, il dominio catalitico, a seguito della autofosforilazione. La migrazione di P 27 e P 34 autofosforilati mostra un sovrapposizione sul gel proteico a causa della migrazione ritardata del frammento P 27 completamente fosforilato rispetto alla PAC due non fosforilata.

Questo spettro di massa mostra un andamento temporale dell'incorporazione di deuterio per il PAC inattivo due. Il picco MZ 1697.85 è composto da multipli picchi isotopici, come mostrato dallo spostamento dell'inviluppo di massa. Nel tempo, la linea rossa tratteggiata indica la media dell'inviluppo di massa e lo spostamento dell'inviluppo di massa mostra la durata di un peptide una volta acquisito.

Questa tecnica può essere completata in due giorni se eseguita correttamente. Non dimenticare che lavorare con azoto liquido può essere estremamente pericoloso, quindi prendere precauzioni come forare il tappo del tubo EOL da 1,5 ml prima di metterlo nell'azoto liquido.