Ammide Idrogeno / Deuterio Scambio & massa MALDI-TOF analisi di spettrometria di attivazione Pak2

Questo esperimento dimostra come utilizzare la spettrometria di massa per monitorare lo scambio idrogeno-deuterio associato alle proteine. I cambiamenti strutturali che portano agli stati di attivazione prima della proteina chinasi Cleve PAC due con caspasi tre e poi attivano PAC due mediante autofosforilazione utilizzando un TP come substrato come secondo passaggio digeriscono PAC due con pepina e analizzano il Prote PAC due frammenti mediante spettrometria di massa tandem procedere all'analisi dei modelli di scambio idrogeno-deuterio di PAC due mediante monitoraggio della durata di ciascun PAC due frammento il preciso livello di scambio idrogeno-deuterio utilizzando lo stampo per l'analisi. Fornire importanti informazioni sulla scissione della caspasi tre e sull'autofosforilazione del PAC due.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande sulla dinamica delle proteine come i cambiamenti conformazionali delle proteine, le interazioni tra ligando proteiche e le interazioni proteina-proteina. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la spettrometria di massa LCQ a scambio HD è fondamentale. Questa procedura non richiede una spettrometria di massa collegata all'HPLC per analizzare i risultati dello scambio HD e la procedura è facile da usare per scindere 0,6 microgrammi di PAC due.

Aggiungere la caspasi tre e incubare la reazione a 34 gradi Celsius per 30 minuti. Verificare il PAC due e completare la scissione del PAC due analizzando i prodotti tramite la pagina SDS. Per la reazione di attivazione, aggiungere la confezione scissa da due a 20 microlitri di tampone di attivazione B e incubare a 34 gradi Celsius per 30 minuti.

Utilizzare la pagina SDS per confermare l'autofosforilazione mediante migrazione dei frammenti P 34 e P 27. Per prima cosa, lavare due volte le velocità aro coniugate con un millilitro di acido trifluoroacetico allo 0,1% e diluire due microlitri da 10 milligrammi per millilitro. Confezione due in 100 microlitri di TFA allo 0,1%, aggiungi 30 microlitri di Pepsi lavata in perline agro coniugate e incuba per cinque minuti.

Procedere all'equilibratura di una colonna H-P-L-C-C 18 in fase inversa con 0,1% di TFA a pH 2,5. Ora carica il Pepin Digest e diluisci utilizzando un gradiente lineare di 100 minuti. Raccogliere le frazioni ogni due minuti dopo l'essiccazione delle frazioni HPLC con una velocità VAC reus.

Sospendere i campioni in cinque microlitri di aceto nitrile e 0,1% di TFA a pH 2,5. Come schermata iniziale. Analizzare ogni frazione per peptidi da muffa a tutte le frazioni contenenti peptidi.

Identificare i frammenti mediante spettrometria di massa tandem. Utilizzare la funzione del prodotto MS nel prospettore proteico per abbinare gli ioni figli e i rapporti MZ teorici basati sulla sequenza primaria di PAC due. Per prima cosa equilibrare tutte le soluzioni e i reagenti per lo scambio idrogeno-deuterio.

Avviare lo scambio idrogeno-deuterio aggiungendo 18 microlitri di tampone D due O a due microlitri da 10 milligrammi per millilitro. Pacchetto due, esegui reazioni in triplice copia nel corso del tempo. Spegnere la reazione idrogeno-deuterio con 180 microlitri di TFA ghiacciato allo 0,1% a pH 2,2.

Ora distribuisci 100 microlitri di aliquote di idrogeno deuterio. Confezione da due a 30 microlitri di perle aggregate coniugate con pepina attivata. Incubare questa digestione delle pepine con ghiaccio per cinque minuti.

Il vortice ogni 30 secondi termina efficacemente le reazioni di digestione mediante centrifugazione per rimuovere rapidamente la pepina. Congelare i campioni in azoto liquido per l'analisi della muffa. Preparare la matrice e conservarla a zero gradi Celsius, scongelare parzialmente ogni campione rapidamente.

Mescolare un microlitro di campione con un microlitro di matrice, quindi posizionare su una piastra bersaglio ammuffita a quattro gradi Celsius 30 secondi prima dell'ammuffimento per l'analisi. Applicare un vuoto moderato sulla piastra per farla asciugare. Le macchie continuano ad acquisire spettri ammuffiti o di massa: in media 100 scansioni in due minuti.

Procedere con l'utilizzo del programma per computer Data Explorer 4.0 per calcolare la durata di ciascun frammento. Quindi calcola lo scambio di ritorno in base al rapporto tra l'effettivo incorporato a causa di un numero a 24 ore di scambio idrogeno-deuterio diviso per tutti i possibili siti scambiabili, che sono le ammidi della spina dorsale, ad eccezione dell'ammide terminale terminale. In questo esempio, la scissione e l'autofosforilazione di CASP Bay sono verificate dalla colorazione Kumasi della pagina SDS.

Il PAC 2 inattivo non fosforilato è una singola banda di 58 kilodalton CASP bay. La scissione di PAC 2 è completa e produce due frammenti, P 27, il dominio regolatorio e P 34, il dominio catalitico in seguito all'autofosforilazione. La migrazione di P 27 e P 34 autofosforilati mostra una sovrapposizione sul gel proteico a causa della migrazione ritardata del frammento di P 27 completamente fosforilato rispetto al secondo pacchetto non fosforilato.

Questo spettro di massa mostra un andamento temporale dell'incorporazione del deuterio per il PAC 2 inattivo. Il picco MZ 1697.85 è composto da più picchi isotopici, come mostrato dallo spostamento dell'inviluppo di massa. Nel tempo, la linea tratteggiata rossa indica la media dell'inviluppo di massa e lo spostamento dell'inviluppo di massa mostra la durata di un peptide Una volta padroneggiato.

Questa tecnica può essere completata in due giorni se viene eseguita correttamente. Non dimenticare che lavorare con l'azoto liquido può essere estremamente pericoloso, quindi prendi precauzioni come praticare un foro sul tappo della provetta EOL da 1,5 mil prima di metterla nell'azoto liquido.